王立峰，王玉梅，張 晶，謝慧慧，鞠興榮

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210023）

我國(guó)油菜種植面積和總產(chǎn)量占世界30%左右，居于世界首位[1]。油菜籽是重要的植物蛋白質(zhì)資源，去油后的菜籽餅粕中約含有30%～45%的蛋白質(zhì)，菜籽蛋白主要由12S球蛋白和2S清蛋白組成[2]。以菜籽蛋白為原料可通過(guò)降解得到小分子的菜籽多肽，某些小分子菜籽肽吸收快、耗能低、吸收率高，并且在抗氧化、降血壓、抗腫瘤等方面顯示重要的生物活性[3]。郭興鳳等[4]研究表明菜籽蛋白的酶水解產(chǎn)物具有抗氧化活性；薛照輝等[5]利用雙酶分步水解菜籽清蛋白后，經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析柱分離純化，得到分子質(zhì)量降級(jí)的3個(gè)組分，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，這些菜籽肽具有較強(qiáng)的還原能力及抑制羥自由基（?OH）的作用；Yoshie-Stark等[6]以菜籽分離蛋白為底物經(jīng)酶水解后得到的菜籽多肽具有顯著的1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力。有研究學(xué)者認(rèn)為[7]，菜籽肽由于富含供氫體，所以具有提供氫質(zhì)子的能力，使具有高度氧化性的自由基還原，從而能終止自由基連鎖反應(yīng)，起到清除或抑制自由基的作用。目前評(píng)價(jià)抗氧化活性最為簡(jiǎn)便、靈敏的為抗氧化自由基吸收能力法[8]（oxygen radical absortion capacity，ORAC）。Wolf等[9]建立了細(xì)胞內(nèi)測(cè)定抗氧化活性的方法（cellular antioxidant capacity，CAA），從細(xì)胞層次上反映抗氧化劑的吸收代謝的情況。本實(shí)驗(yàn)主要是用堿性蛋白酶水解菜籽蛋白后通過(guò)聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠柱（Sephacryl S-100HR）分級(jí)得到不同組分的菜籽蛋白水解物（rapeseed protein hydrolysates，RPHs），通過(guò)體外ORAC和細(xì)胞內(nèi)CAA兩種抗氧化評(píng)價(jià)方法分析各組分RPHs的抗氧化性，篩選出抗氧化性較高的組分，并對(duì)其進(jìn)行氨基酸分析，確定組分中氨基酸組成，為后續(xù)菜籽肽功能性的機(jī)理研究提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2人體肝癌細(xì)胞 上海細(xì)胞庫(kù)；甘藍(lán)型“雙低”油菜籽秦優(yōu)7號(hào)，購(gòu)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子公司，樣品脫殼后，石油醚索氏抽提去脂，通風(fēng)櫥中平鋪晾干，旋風(fēng)磨粉碎過(guò)100 目篩后備用。

Sephacryl S-100HR凝膠填料 美國(guó)GE公司；多肽聚丙烯酰胺凝膠電泳分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物 美國(guó)Bio-Rad公司；Alcalase 2.4L 丹麥諾維信公司；N,N’-甲叉雙丙烯胺、Tris、過(guò)硫酸銨、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）、N,N,N’,N’-四甲基二乙胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、丙烯酰胺（acrylamide，Acr）、兩性離子緩沖液（Tricine）、考馬斯亮藍(lán)R-250、溴酚藍(lán)和β-巰基乙醇、熒光素鈉鹽（fluorescein sodium salt，F(xiàn)L）、自由基產(chǎn)生劑AAPH（2,2’-azobis-2-amidinopropanedihydrochloride）、抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水溶性VE（6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）美國(guó)Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、雙抗（青霉素10 000 U/mL，鏈霉素10 000 U/mL）、四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液（0.25%）、Hank平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）等細(xì)胞培養(yǎng)試劑 美國(guó)Gibco生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

E-812索氏抽提裝置 南京晚晴化玻儀器有限公司；Beckman Coulter J6冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；FreeZone 2.5L臺(tái)式冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司；Mini-P4微型垂直電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Millipore Pellicon XL小型超濾裝置 美國(guó)Merck Millipore公司；SpectraMax M2e酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；HERAcell 150i二氧化碳培養(yǎng)箱、MSCAdvantage-1.2生物安全柜 美國(guó)Thermo Scientific公司；HL-2恒流泵、HD-3紫外檢測(cè)儀、BSZ-100自動(dòng)收集器、XWT-S小型臺(tái)式記錄儀 上海滬西分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 RPHs的制備

按照本實(shí)驗(yàn)室的方法制備。稱100 g菜籽粉溶于2 000 mL的蒸餾水，調(diào)pH值為11左右，室溫?cái)嚢? h后于4 000×g離心分離10 min，收集上清液。調(diào)節(jié)上清液的pH值為4.5，靜置30 min，4 000×g離心分離10 min后棄上清液，用95%的乙醇洗滌沉淀2次，冷凍干燥得菜籽蛋白。取20 g按上述步驟所得到的菜籽蛋白溶于400 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為9，加入400 μL的堿性蛋白酶酶解液，溫度控制在50℃，酶解過(guò)程維持pH值不變，5 h后水浴滅酶15 min，冷卻后調(diào)pH值至4.5，30 min后，離心分離20 min（4℃，10 000×g），收集上清液，將其pH值調(diào)至7.0，過(guò)0.45 μm微濾膜，冷凍干燥后得RPHs。

1.3.2 Sephacryl S-100HR過(guò)濾

將得到的RPHs配成0.01 g/mL的溶液，經(jīng)過(guò)由層析柱、恒流泵、自動(dòng)部分收集器和紫外檢測(cè)器組成的液相色譜分離層析系統(tǒng)，于紫外波長(zhǎng)280 nm、洗脫流速60 mL/h的條件下先后收集得到3個(gè)不同的組分的菜籽肽，冷凍干燥后儲(chǔ)存于－20℃，備用。

1.3.3 菜籽肽各級(jí)分的抗氧化能力指數(shù)ORAC分析

參照文獻(xiàn)[10]方法，反應(yīng)于96 孔板中進(jìn)行，每個(gè)孔加入20 μL RPHs樣品溶液（質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL）或者20 μL不同質(zhì)量濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品，RPHs各級(jí)分樣品用75 mmol/L的磷酸緩沖液稀釋，之后加入200 μL的熒光指示劑（0.96 μmol/L），在酶標(biāo)儀中溫育后（37℃，15 min），每孔再加入20 μL現(xiàn)配的119 mmol/L偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2’-azobis（2-methylpropionamide）dihydrochloride，ABAP），于波長(zhǎng)485 nm處激發(fā)，每5 min在波長(zhǎng)520 nm處釋放測(cè)定。各樣品組均設(shè)3～5個(gè)復(fù)孔。ORAC值用Trolox當(dāng)量（μmol TE/g）表示。

1.3.4 Hep G2細(xì)胞的MTT毒性實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep G2細(xì)胞，于96 孔中每孔接種104個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞液的加入量為100 μL，于37℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，向每孔中加入100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于每孔中再加入20 μL的MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h后吸出舊的培養(yǎng)液，加入150 μL的DMSO，37℃條件下輕微振蕩30 min，待充分溶解形成深藍(lán)色結(jié)晶后，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定OD值，對(duì)照組以等體積細(xì)胞培養(yǎng)液代替樣品溶液。按照公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中：OD1為樣品光密度值；OD0為對(duì)照組光密度值。

1.3.5 細(xì)胞抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

采用文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行細(xì)胞抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，于96 孔板上按密度6×104個(gè)/每孔接種Hep G2細(xì)胞，細(xì)胞液加入量為100 μL，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中（37℃、5% CO2）培養(yǎng)24 h后棄去舊培養(yǎng)液，用PBS清洗接種孔，再加入100 μL RPHs樣品處理液（用同等體積的樣品稀釋液：25 μmol/L二氯熒光黃二乙酸酯（dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）稀釋），繼續(xù)培養(yǎng)1 h后棄去舊的培養(yǎng)液，加入100 μL的600 μmol/L的ABAP，放入熒光酶標(biāo)儀中讀數(shù)，于恒溫37℃，波長(zhǎng)538 nm處激發(fā)，每5 min在波長(zhǎng)485 nm處釋放測(cè)定1 h。參照公式（2）計(jì)算細(xì)胞抗氧化能力。

式中：∫SA表示RPHs樣品曲線下的積分面積；∫CA表示對(duì)照組曲線下的積分面積。樣品的半數(shù)有效濃度（EC50）以lg（?a/?u）對(duì)lgρ的中效原理來(lái)計(jì)算，這里?a表示樣品作用效應(yīng)（CAA），?u表示1－CAA，ρ表示RPHs質(zhì)量濃度。EC50值以3次平行實(shí)驗(yàn)計(jì)算得出，將EC50值轉(zhuǎn)化為CAA值，以每克樣品中相當(dāng)于槲皮素的微摩爾當(dāng)量來(lái)表示。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

相關(guān)性分析采用SPSS17.0軟件中的Correlate進(jìn)行分析。樣品間差異顯著性采用SPSS17.0軟件中單因素方差分析中的最小顯著性檢驗(yàn)和Duncan’s多重比較分析，顯著水平設(shè)為P＜0.05。

1.3.7 RPHs各級(jí)分的凝膠電泳

電泳凝膠及緩沖液的配制參照文獻(xiàn)[12]中Tricine-SDS-PAGE的配制方法，并做適當(dāng)修改，采用16.5%分離膠和5%的濃縮膠。具體方法如下：將通過(guò)Sephacryl S-100HR凝膠柱的RPHs各級(jí)分配成10 mg/mL的溶液，與樣品緩沖液按體積1∶1混合，100℃煮沸5 min，上樣量為10 μL，電壓100 V，時(shí)間為2～3 h后于固定液中固定20 min，考馬斯亮藍(lán)G-250染色30 min，過(guò)夜脫色，待膠片背景藍(lán)色呈透明狀時(shí)拍照，觀察并分析RPHs各級(jí)分的分子質(zhì)量分布。

1.3.8 氨基酸組分分析

在10 mL玻璃水解管中稱取RPHs樣品后，加入6 mol/L的鹽酸，用氮?dú)庵脫Q并在減壓狀態(tài)下使用酒精噴燈迅速封管，在110℃條件下水解反應(yīng)24 h；反應(yīng)結(jié)束后打開水解管，濃縮水解液，用0.02 mol/L的鹽酸溶解后用去離子水稀釋至50 mL；然后以1 500 r/min 離心5 min，所得上清液過(guò)0.22 μm濾器后移入2 mL樣品瓶中，采用氨基酸自動(dòng)分析儀中進(jìn)行氨基酸組分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPHs的分離純化

RPHs的樣品液（0.01 g/mL）于60 mL/h的洗脫流速，波長(zhǎng)2 8 0 n m的紫外檢測(cè)條件下經(jīng)過(guò)Sephacryl S-100HR凝膠柱層析分離，按照洗脫時(shí)間和紫外檢測(cè)的OD280nm值作圖，可以得到3個(gè)洗脫峰，如圖1所示。分別收集所得到的3個(gè)組分，冷凍干燥后進(jìn)行抗氧化分析。

圖1 Sephacryl S-100HR純化RPHs的柱層析圖Fig.1 Column chromatography of RPHs on Sephacryl S-100HR

2.2 RPHs及其各組分的ORAC分析

ORAC法是目前評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)抗氧化活性的較為簡(jiǎn)單、有效、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣的方法之一，提供了穩(wěn)定、可控的自由基，這些自由基與生物活動(dòng)產(chǎn)生中的自由基相一致[13]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)多通道液體處理系統(tǒng)和微孔板分析儀的使用所測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確，實(shí)現(xiàn)了ORAC測(cè)定的自動(dòng)化及高通量化，分析效率提高[14]。此方法已應(yīng)用于生物樣品、水果蔬菜和果汁飲料等多種樣品的體內(nèi)、外抗氧化能力分析。本研究中，RPHs及凝膠柱分離的各組分的ORAC值見圖2。

圖2 RPHs與凝膠分離菜籽肽各組分的抗氧化能力Fig.2 Antioxidant activities of three fractions of RPHs

由圖2可知，同其他的RPHs組分相比，組分3的ORAC值最高，達(dá)到（1 610.38±112.51）μmol TE/g。其體外抗氧化性顯著高于其他組分和原始蛋白水解物。曹亞蘭等[15]以O(shè)RAC值為評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)制備大豆抗氧化肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白經(jīng)Alcalase酶解產(chǎn)物的ORAC最高值可達(dá)1 900.48 μmol TE/g，與本實(shí)驗(yàn)組分3的抗氧化性差別不大。

2.3 RPHs及其各組分對(duì)細(xì)胞毒性的影響

驗(yàn)證RPHs及各組分對(duì)Hep G2細(xì)胞的抑制作用是源于其潛在的細(xì)胞毒性，本研究采用MTT的方法測(cè)定了RPHs和各組分對(duì)Hep G2細(xì)胞是否具有細(xì)胞毒性作用。配制25～400 mg/L質(zhì)量濃度的RPHs培養(yǎng)Hep G2細(xì)胞24 h后，通過(guò)與對(duì)照組細(xì)胞的OD570nm值的變化可以比較測(cè)定出樣品的細(xì)胞毒性，結(jié)果見圖3。

圖3 RPHs及凝膠柱分離各組分對(duì)細(xì)胞毒性的影響Fig.3 Cytotoxicity of RPHs and three fractions using MTT assay

由圖3可知，RPHs各組分中200、400 mg/L的質(zhì)量濃度組可以顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖；當(dāng)質(zhì)量濃度為400 mg/L時(shí)，樣品各組分都顯示了一定的細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率降為70%左右；當(dāng)質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，RPHs和組分1產(chǎn)生了較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。組分2和組分3處理的細(xì)胞組在25～200 mg/L質(zhì)量濃度范圍，細(xì)胞存活率均達(dá)到75%以上，表明無(wú)明顯的細(xì)胞毒性；因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將以此范圍作為依據(jù)，作為無(wú)細(xì)胞毒性的使用劑量。

2.4 RPHs及各組分的細(xì)胞抗氧化分析

本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞抗氧化能力的測(cè)定是直接采用不使用PBS清洗的測(cè)定方法，即加入RPHs及各組分樣品培養(yǎng)1 h后，不使用PBS清洗細(xì)胞孔，直接加入含有ABAP的處理液進(jìn)行熒光檢測(cè)。RPHs及各組分細(xì)胞抗氧化能力的EC50值見圖4。RPHs及其各組分抗氧化性差異顯著，其中組分1的EC50最高，為（187.39±21.71）μg/mL，組分3的EC50的最低，為（57.84±3.38）μg/mL，組分3的抗氧化效果最好。

圖4 RPHs及凝膠柱分離各組分細(xì)胞抗氧化的EC5500值Fig.4 EC50 values of RPHs and three fractions

圖5 RPHs及凝膠柱分離各組分細(xì)胞抗氧化CAA值Fig.5 CAA values of RPHs and three fractions

RPHs及各組分的細(xì)胞抗氧化CAA值見圖5。經(jīng)過(guò)比較可看出組分3的CAA值最高為（124.66±2.18）μmol QE/g，相對(duì)應(yīng)的組分1的CAA值最低為（28.96±0.31）μmol QE/g。

2.5 相關(guān)性分析

對(duì)RPHs及各組分的ORAC值和CAA值之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，其Pearson相關(guān)系數(shù)為0.838，相關(guān)系數(shù)的顯著水平為0.001，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性（CAA法）和體外抗氧化活性（ORAC法）兩者之間具有極顯著的相關(guān)性（P＜0.05）。

2.6 RPHs及各組分的Tricine-SDS-PAGE電泳

圖6 RPHs及各組分的凝膠電泳圖Fig.6 Electrophoretic patterns of RPHs and three fractions

圖6反映出RPHs及各組分的分子質(zhì)量的排布，組分3的分子質(zhì)量集中在1 423～3 496 D之間，組分2的分子質(zhì)量則集中在6 512～14 437、1 423～3 496 D之間，組分1的分子質(zhì)量集中在26 625 D上下，RPHs的分子質(zhì)量主要集中在26 625、6 512～14 437、3 496 D這3個(gè)范圍。由以上實(shí)驗(yàn)可看出不同組分RPHs的ORAC值變化規(guī)律與CAA值相同，其抗氧化活性大小表現(xiàn)為：組分3＞RPHs＞組分2＞組分1。其中組分3顯示較強(qiáng)的抗氧化性，其分子質(zhì)量分布集中在1 423～3 496 D之間。有研究結(jié)果也顯示了蛋白降解物的抗氧化性與它們的分子質(zhì)量分布有著一定的關(guān)系[16-17]。Xie等[18]水解苜蓿葉蛋白得到的抗氧化肽的分子質(zhì)量主要集中在1 000 D以下。Li等[19]通過(guò)水解鷹嘴豆蛋白得到抗氧化活性較高的組分的分子質(zhì)量集中在940～2 622 D之間和220～940 D之間。這些結(jié)果都表明肽的分子質(zhì)量分布與其抗氧化活性有著內(nèi)在的聯(lián)系。

2.7 氨基酸組分分析

由ORAC和CAA實(shí)驗(yàn)得出組分3的抗氧化性明顯大于其他各組分和RPHs樣品，對(duì)抗氧化性最好的組分3進(jìn)行氨基酸分析。氨基酸分析結(jié)果見表1，可知組分3中Glu、Gly、Ala、Tyr、Pro等氨基酸的含量較高。多肽的抗氧化活性的強(qiáng)弱與氨基酸組成、種類、疏水性以及在肽鏈中的位置有關(guān)[20-21]，研究發(fā)現(xiàn)Cys、Met、Tyr、Lys、Arg、Glu、Asp、Ser、Pro、Phe、Ala以及His都是具有一定抗氧化活性的氨基酸，它們?cè)谛蛄兄谐霈F(xiàn)能夠不同程度的增強(qiáng)多肽抗氧化特性[22-23]。此外，組分3中必需氨基酸占總含量的18.23%，因此也具有比較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表1 組分3的氨基酸組分分析Table1 Amino acid composition of fraction 3

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了RPHs及凝膠過(guò)濾各組分的抗氧化能力分析，利用體外抗氧化法（ORAC）和細(xì)胞內(nèi)抗氧化法（CAA）評(píng)價(jià)其抗氧化性。結(jié)果表明，ORAC值與CAA值具有相同變化規(guī)律，其抗氧化活性大小表現(xiàn)為：組分3＞RPHs＞組分2＞組分1。其中組分3抗氧化活性最強(qiáng)，其分子質(zhì)量集中處于1 423～3 496 D之間，除此之外，菜籽蛋白水解物的抗氧化活性可能還與其氨基酸組成有關(guān)。

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