丁 艷，李麗倩，顧振新，韓永斌

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

油菜籽餅粕富含蛋白質(zhì)和氨基酸，是一種潛在的食用蛋白源。但是硫代葡萄糖苷（簡(jiǎn)稱硫苷）等抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在，限制了其在食品和飼料的利用，大部分作為肥料造成資源的浪費(fèi)[1]?，F(xiàn)有研究[2-5]表明硫苷降解產(chǎn)物之一——異硫氰酸酯類物質(zhì)不僅是形成十字花科蔬菜和調(diào)味品風(fēng)味的化合物，還具有參與植物防御、生長(zhǎng)素動(dòng)態(tài)平衡及人類癌癥預(yù)防等生物活性，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。

黑芥子酶（EC3.2.3.1）是一種可以降解硫苷的水解酶，主要分布于十字花科植物體內(nèi)[6-7]，可將硫苷降解成硫氰酸酯、異硫氰酸酯、惡唑烷硫酮和腈等物質(zhì)[8]，這些降解產(chǎn)物的組成和比例受黑芥子酶性質(zhì)、硫苷側(cè)鏈、pH值及金屬離子的影響[9-12]。由于亞基、分子質(zhì)量及糖基化程度不同，植物中形成不同形式和結(jié)構(gòu)的黑芥子酶。黑芥子酶的三維結(jié)構(gòu)，以及黑芥子酶結(jié)合蛋白和協(xié)助蛋白對(duì)硫苷降解的影響，主要表現(xiàn)在不同來(lái)源的黑芥子酶對(duì)相同硫苷的降解率[13]和硫苷的降解產(chǎn)物組分[14]存在差異。Shen Lianqing等[15]添加西蘭花種子黑芥子酶能提高西蘭花種子異硫氰酸酯含量，減少腈類等物質(zhì)的產(chǎn)生，但關(guān)于不同來(lái)源的黑芥子酶對(duì)硫苷降解產(chǎn)物組分的研究鮮有報(bào)道。本研究比較了十字花科種子中黑芥子酶對(duì)油菜籽餅粕中硫苷降解組分的影響，以期獲得能減少有毒副作用的惡唑烷酮及腈類物質(zhì)產(chǎn)生、盡可能多的生成異硫氰酸酯的黑芥子酶，為油菜籽餅粕的合理利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜籽、油菜籽餅粕 南京隆盛油脂有限公司；白菜籽（抗病北京3號(hào)大白菜）、蘿卜籽（夏秋白蘿卜）、西蘭花籽（綠玉80 d）、芥藍(lán)籽（香港白花芥藍(lán)）、芥菜籽（花葉香芥菜）、甘藍(lán)籽（精選8132F1甘藍(lán)） 南京金盛達(dá)種子公司。

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙二胺四乙酸二鈉、二硫蘇糖醇、甘油、硫酸銨、二氯甲烷、聚乙二醇均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；黑芥子硫苷酸鉀（＞99%）標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

12～14 kD透析袋 美國(guó)Pharmacia公司；FSD-100A型電動(dòng)粉碎機(jī) 臺(tái)州市新恩精密糧儀有限公司；JA2003電子天平 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；AUY120精密天平 日本Shimadzu公司；Orion818型pH測(cè)定儀日本Orion公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；TDL-40B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；UV-2802型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Agilent 7890/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 黑芥子酶的提取

黑芥子酶（西蘭花籽、油菜籽、白菜籽、蘿卜籽、芥藍(lán)籽、甘藍(lán)籽和芥菜籽黑芥子酶分別簡(jiǎn)寫(xiě)為BSm、RPSm、WCSm、RDSm、KSm、CSm、MSm）提取方法參照文獻(xiàn)[16]，6 g種子經(jīng)電動(dòng)粉碎機(jī)碎成粉末，加入60 mL 10 mmol/L磷酸鉀緩沖液（其中添加1 mmol/L EDTA、3 mmol/L二硫蘇糖醇、5%甘油）（pH 7.2），冰浴研磨，冰浴條件下超聲破碎20 min，4 層紗布過(guò)濾除濾渣，濾液在4 ℃、16 000 r/min離心30 min，取上清液50 mL，加入固體硫酸銨使上清液飽和度達(dá)到55%，4 ℃放置1 h，16 000 r/min冷凍離心30 min，使黑芥子酶聚集，取沉淀溶于4 mL去離子水中，并用去離子水透析4 ℃過(guò)夜，透析袋取出后表面擦干，放入盛有聚乙二醇的燒杯內(nèi)，4 ℃放置0.5 h，得到黑芥子酶提取濃縮液，0.066 7 mol/L 磷酸鉀緩沖液定容至30 mL。

1.3.2 黑芥子酶活力的測(cè)定

在Eylen等[17]的基礎(chǔ)上改進(jìn)，1.50 mL 0.066 7 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）、500 μL抗壞血酸溶液（1 mmol/L）、50 μL黑芥子硫苷酸鉀溶液（25.18 mmol/L）和20 μL酶液，分別在37 ℃條件下保溫，混合平衡1 min。置于1 cm光路石英比色皿中，37 ℃反應(yīng)30 min，測(cè)定227 nm波長(zhǎng)處吸光度計(jì)算酶活力。分別取25.18 mmol/L黑芥子硫苷酸鉀標(biāo)品0、12.5、25、37.5、50、70 μL，用緩沖液將其定容至2.07 mL，測(cè)定其在227 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.948 4X-0.002 8（R2=0.999 4）。

酶活力單位定義[16]：在pH 6.5、37 ℃條件下，1 min催化1 μmol的黑芥子硫苷酸鉀所需要的酶量稱為1 個(gè)活力單位（U）。酶比活力（U/mg）單位定義為每毫克蛋白質(zhì)中黑芥子酶的活力。

式中：N為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)黑芥子酶降解黑芥子硫苷酸鉀的量/μmol；t為反應(yīng)時(shí)間/min；VE為酶液體積/mL；VEX為提取液體積/mL。

1.3.3 總蛋白的測(cè)定

參照考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[18]。

1.3.4 硫苷降解產(chǎn)物的制備與提取

油菜籽餅粕粉碎后過(guò)60 目篩，90 ℃干燥4 h至恒質(zhì)量。

取1.3.1節(jié)黑芥子酶提取液5 mL，與5 mL 0.066 7 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）混合，加入1.00 g油菜籽餅粕，40 ℃水浴反應(yīng)2 h，100 ℃滅酶15 min。加入5 mL二氯甲烷提取30 min，5 000 r/min離心15 min，取有機(jī)層過(guò)0.45 μm膜，35 ℃旋轉(zhuǎn)真空濃縮，得到降解產(chǎn)物提取物。

同時(shí)制得黑芥子酶提取液和不加酶的油菜籽餅粕的降解產(chǎn)物提取物。

1.3.5 GC-MS分析條件

色譜柱：Hp-5ms石英毛細(xì)管柱；載氣：氦氣；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫條件：起始35 ℃保持5 min，以10 ℃/min升溫至210 ℃保持5 min。

質(zhì)譜條件：EI離子源溫度：240 ℃；接口溫度：250 ℃；四極桿溫度：150 ℃；EI能量：70 eV；掃描范圍m/z：50～240。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

GC-MS數(shù)據(jù)通過(guò)化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理軟件分析譜圖，檢索NIST08譜圖庫(kù)，結(jié)合人工圖譜解析及資料分析，確定揮發(fā)性物質(zhì)的各個(gè)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式，按峰面積歸一化法求得各成分相對(duì)百分含量，僅當(dāng)匹配度大于80%（完全匹配為100%）的鑒定結(jié)果才予以報(bào)道。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種十字花科植物種子黑芥子酶比活力比較

圖1 7種十字花科植物種子黑芥子酶活性比較Fig.1 Myrosinase activities in seven cruciferous seeds

由圖1可知，7 種十字花科植物種子黑芥子酶的比活力從高到低依次為，西蘭花籽、油菜籽、白菜籽、蘿卜籽、芥藍(lán)籽、甘藍(lán)籽、芥菜籽。其中BSm酶比活力最高，為69.4 U/mg，顯著高于其他酶比活力（P＜0.05）。RPSm次之，為59.8 U/mg，MSm酶比活力最低，為14.5 U/mg。

2.2 不同來(lái)源黑芥子酶對(duì)油菜籽餅粕中硫苷降解產(chǎn)物組分的影響

對(duì)7 種來(lái)源不同的黑芥子酶液及其酶解油菜籽餅粕中的硫苷降解產(chǎn)物GC-MS總離子流圖進(jìn)行計(jì)算機(jī)譜庫(kù)檢索，總離子流圖見(jiàn)圖2。

圖2 不同來(lái)源黑芥子酶酶解硫苷產(chǎn)物及黑芥子酶提取物總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of hydrolysates of glucosinolates by myrosinases from different cruciferous seeds and compounds in the extract of myrosinase

2.2.1 添加外源RPSm降解油菜籽餅粕中硫苷的產(chǎn)物

由表1可知，油菜籽餅粕中的硫苷經(jīng)RPSm降解后的產(chǎn)物（稱為基本產(chǎn)物）主要包括6 種，即3種異硫氰酸酯：1-丁烯基-4-異硫氰酸酯（31.20%）、烯丙基異硫氰酸酯（1.46%）、2-苯乙基異硫氰酸酯（1.04%）；1 種腈類物質(zhì)：苯丙腈（3.90%）和2 種惡唑：致甲狀腺腫素（28.59%）、2,1-苯并異惡唑（2.11%）。而對(duì)照只檢測(cè)到4 種物質(zhì)：烯丙基異硫氰酸酯（0.13%）、1-丁烯基-4-異硫氰酸酯（1.73%）、致甲狀腺腫素（2.38%）、2,1-苯并異惡唑（0.14%）。與對(duì)照相比，外加RPSm后，1-丁烯基-4-異硫氰酸酯相對(duì)含量從1.73%增至31.20%，致甲狀腺腫素相對(duì)含量從2.11%增至28.59%，烯丙基異硫氰酸酯從0.13%升至1.46%，2,1-苯并異惡唑從0.14%升至2.11%。可以看到，外加RPSm不僅能增加產(chǎn)物組分種類，還增大了各組分的相對(duì)含量。

2.2.2 6種其他來(lái)源的黑芥子酶降解油菜籽餅粕中硫苷生成產(chǎn)物的組成差異

與基本產(chǎn)物相比，6 種其他來(lái)源的黑芥子酶降解產(chǎn)物中新物質(zhì)的種類明顯增加。WCSm降解油菜籽餅粕中的硫苷不僅產(chǎn)生基本產(chǎn)物，還產(chǎn)生了1-丁基異硫氰酸酯（0.93%）、1-戊烯基,5-腈（0.62%）和3-吲哚乙腈（1.16%）3 種新物質(zhì)。RDSm的降解產(chǎn)物中有丁腈（0.3%）、硫雜環(huán)戊烷-3,4-二腈（9.67%）、2,4-二甲基惡唑（4.05%）和5-甲氧基-4-甲基-2,1,3-苯并惡唑（11.35%）。BSm降解產(chǎn)物中同樣產(chǎn)生3 種新產(chǎn)物：硫雜環(huán)戊烷-3,4-二腈（3.82%）、2-乙基-4甲基-惡唑（5.94%）、3-吲哚乙腈（1.56%）。KSm和CSm產(chǎn)生1-丁基異硫氰酸酯、3-吲哚乙腈、2-氰基甲基-1,3-苯并惡唑等3 種新產(chǎn)物。添加來(lái)自MSm產(chǎn)生2 種新物質(zhì)，即1-丁基異硫氰酸酯（3.75%）和3-吲哚乙腈（2.74%）。

表1 十字花科植物種子黑芥子酶降解油菜籽餅粕中硫苷產(chǎn)物組分Table 1 Glucosinolate degradation products in rapeseed meal hydrolyzed by myrosinases from different cruciferous seeds

添加外源黑芥子酶，降解產(chǎn)物中出現(xiàn)了新物質(zhì)，同時(shí)減少了基本產(chǎn)物的組成和含量。RDSm降解產(chǎn)物中未檢測(cè)到烯丙基異硫氰酸酯和2-苯乙基異硫氰酸酯，MSm中未檢測(cè)到1-丁烯基-4-異硫氰酸酯。這6 種黑芥子酶均未檢測(cè)到2,1-苯并異惡唑。推測(cè)是不同來(lái)源的黑芥子酶影響硫苷降解產(chǎn)物的組成[13]。

2.2.3 6種其他來(lái)源的黑芥子酶對(duì)基本產(chǎn)物相對(duì)含量的影響

1-丁烯基-4-異硫氰酸酯是主要降解產(chǎn)物，在CSm、RPSm、WCSm、BSm和KSm 5 種黑芥子酶降解產(chǎn)物中含量較高，相對(duì)含量分別為33.22%、32.20%、29.46%、26.91%和26.61%；RDSm含量最低為0.54%，而MSm未檢測(cè)到。但MSm和RDSm降解產(chǎn)物中苯丙腈含量顯著高于其他黑芥子酶的產(chǎn)生量，分別為7.94%和7.01%。此外，MSm降解產(chǎn)物中致甲狀腺腫素含量最高，為29.35%；WCSm與RPSm生成量相近，分別為28.83%和28.59%；CSm、BSm、KSm和RDSm生成致甲狀腺腫素相對(duì)含量分別為17.50%、15.94%、13.59%和12.59%。MSm不產(chǎn)生1-丁烯基-4-異硫氰酸酯，但致甲狀腺腫素含量高于其他黑芥子酶的生成量，可能與黑芥子酶降解硫苷的特異性有關(guān)[23]。

RDSm降解產(chǎn)物中未檢測(cè)到烯丙基異硫氰酸酯和2-苯乙基異硫氰酸酯，其他6 種十字花科種子黑芥子酶降解產(chǎn)物中均檢測(cè)到。這2 種產(chǎn)物在KSm降解產(chǎn)物中含量最高，分別為1.86%和2.18%；CSm相對(duì)含量最小，分別為1.12%和1.45%。不同黑芥子酶生成這2 種異硫氰酸酯在的含量差別較小。

3 討 論

3.1 7種黑芥子酶活性差異分析

本實(shí)驗(yàn)比較了7 種黑芥子酶比活力，不同來(lái)源的黑芥子酶比活力存在顯著差異。朱磊[16]研究本實(shí)驗(yàn)7 種黑芥子酶活性，BSm的活性最高，KSm活性最低。Bones[19]測(cè)定RPSm、WCSm和RDSm活力，發(fā)現(xiàn)RPSm活性最低。以上報(bào)道均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，可能與黑芥子酶的活性與植物種類、品種和器官有關(guān)[3]。據(jù)報(bào)道，黃芥籽中的內(nèi)生黑芥子硫苷酸鉀含量較高，其內(nèi)源黑芥子酶對(duì)黑芥子硫苷酸鉀的比活力很低，但對(duì)于4-甲基亞磺酰丁基芥子油苷的降解率較高[16]，說(shuō)明酶的底物也是影響黑芥子酶活性的重要因素[9]。

3.2 7 種黑芥子酶對(duì)油菜籽餅粕中硫苷降解產(chǎn)物組分差異分析

不同來(lái)源的黑芥子酶降解油菜籽餅粕中的硫苷，同一種產(chǎn)物的相對(duì)含量存在差異。實(shí)驗(yàn)中BSm的活性最高，顯著高于CSm，但CSm產(chǎn)生1-丁烯基-4-異硫氰酸酯高于BSm生成量，在相同硫苷含量的前提下，硫苷降解產(chǎn)物相對(duì)含量并未隨酶活的增加而增加，不同來(lái)源的黑芥子酶對(duì)同一底物硫苷的降解率存在差異[16]，有研究發(fā)現(xiàn)在植物體內(nèi)硫苷含量與黑芥子酶活性無(wú)直接關(guān)系[19]?？梢?jiàn)，酶活不是決定硫苷降解產(chǎn)物含量的必要條件。不同植物種類、器官的存在不同黑芥子酶形式的同工酶，是影響硫苷降解產(chǎn)物含量和種類的重要因素之一[14]。此外，Halkier等[20]研究表明，不同來(lái)源的黑芥子酶對(duì)硫苷的特異性不同，同時(shí)朱磊[16]在研究中指出親緣性較近的植物中黑芥子酶性質(zhì)基本相似。

RDSm產(chǎn)物中未檢測(cè)到烯丙基異硫氰酸酯和2-苯乙基異硫氰酸酯，在關(guān)于蘿卜中風(fēng)味物質(zhì)的研究中[21-22]，相關(guān)物質(zhì)也未見(jiàn)報(bào)道。MSm降解產(chǎn)物中未檢測(cè)到1-丁烯基-4-異硫氰酸酯，在芥菜中[23-24]未檢測(cè)到或相對(duì)峰面積在0.11%。主要是由于蘿卜和芥菜的親緣性與油菜較低，酶的專一性影響黑芥子酶與硫苷的結(jié)合[16]。WCSm、KSm、MSm和CSm降解油菜籽餅粕中硫苷后產(chǎn)生丁基異硫氰酸酯，研究表明這4 種黑芥子酶具有降解硫苷生成丁基異硫氰酸酯的特性，這種特性在植物的不同形態(tài)下選擇性表達(dá)[25-26]。

與基本產(chǎn)物相比，6 種其他來(lái)源的黑芥子酶降解產(chǎn)物中腈類和惡唑類種類增加。7 種黑芥子酶降解產(chǎn)物中均檢測(cè)到苯丙腈和甲狀腺腫素，但是相對(duì)含量不同，這可能與黑芥子酶對(duì)前體硫苷降解率不同相關(guān)[13]。3-吲哚乙腈是WSm、BSm、KSm、MSm和CSm降解硫苷的產(chǎn)物，是黑芥子酶、黑芥子酶協(xié)助蛋白和pH值等共同作用的結(jié)果，也有硫苷代謝途徑研究表明3-吲哚-乙腈途徑是植物中的黑芥子酶遭遇脅迫（如缺硫）產(chǎn)生[27-28]，參與生長(zhǎng)素合成以及植物的防御反應(yīng)。丁腈（0.3%）、硫雜環(huán)戊烷-3,4-二腈（9.67%）、2,4-二甲基惡唑（4.05%）和5-甲氧基-4-甲基-2,1,3-苯并惡唑（11.35%）是RDSm產(chǎn)生的新物質(zhì)。以上4 種新產(chǎn)物在劉賢嫻[21]、Bla?evi?[22]等關(guān)于多品種蘿卜及蘿卜葉的研究中并未檢測(cè)到。RDSm產(chǎn)生腈類和惡唑種類比其他來(lái)源的黑芥子酶多，可能是蘿卜與油菜的物種的親緣性較低，還與RDSm相關(guān)蛋白會(huì)將硫苷酰基化[29-30]有關(guān)，但這些還未被完全證實(shí)。

4 結(jié) 論

7 種十字花科植物種子中黑芥子酶的比活力由高到低的順序依次為BSm、RPSm、WCSm、RDSm、KSm、CSm和MSm；BSm酶比活力最高，為69.4 U/mg，而RPSm為59.8 U/mg，MSm酶比活力最低，為14.5 U/mg。不同來(lái)源黑芥子酶的比活力存在顯著差異。

添加不同來(lái)源黑芥子酶會(huì)使油菜籽餅粕中硫苷降解產(chǎn)物的種類和相對(duì)含量產(chǎn)生明顯差異。WCSm、KSm、MSm及CSm降解產(chǎn)物檢測(cè)到新組分丁基異硫氰酸酯，相對(duì)含量分別為0.93%、1.35%、1.18%和1.36%。CSm產(chǎn)生1-丁烯基-4-異硫氰酸酯含量最高（33.22%），RPSm產(chǎn)生1-丁烯基-4-異硫氰酸酯相對(duì)含量為32.20%；RDSm生成量較少（0.54%），而MSm產(chǎn)物中未檢測(cè)到。除RPSm外，其他6 種降解產(chǎn)物中幾乎不產(chǎn)生2,1-苯并異惡唑，但其他惡唑類及腈類產(chǎn)物種類增加，惡唑類有4 種：2,4-二甲基惡唑，2-乙基-4甲基-惡唑，5-甲氧基-4-甲基-2,1,3-苯并惡唑，2-氰基甲基-1,3-苯并惡唑。腈類主要有3 種：丁腈、1-戊烯基,5-腈和3-吲哚乙腈。不同來(lái)源的黑芥子酶在相同實(shí)驗(yàn)條件下降解油菜籽餅粕中硫苷產(chǎn)生的產(chǎn)物種類和相對(duì)含量存在明顯差異。在油菜籽餅粕中添加RPSm，能有效減少硫苷轉(zhuǎn)化為惡唑類和腈類物質(zhì)。

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