趙 玉 歐陽斌 耿 強，＊

1.天津中醫(yī)藥大學研究生院（300193）；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院男科

男性不育癥是影響家庭和睦以及社會穩(wěn)定的全球性問題。據世界衛(wèi)生組織調查，有將近15%的育齡夫婦存在不孕不育問題，男女雙方原因各占50%［1］，而引起男性不育癥的主要原因包括物理因素、化學因素、內分泌因素、環(huán)境因素、遺傳因素等，但是相當一部分患者原因不明，國內外近年來關于男性不育癥的基礎研究越來越多，相關的動物模型建立發(fā)展迅速。本文將近年來有關男性不育癥動物模型的研究進展進行綜述，為有關男性不育方面的基礎及臨床研究提供參考。

1 物理因素

1.1 熱效應

哺乳動物睪丸的熱敏性決定了其需要在適宜的溫度下才能發(fā)揮正常的生精功能，故大多數雄性動物睪丸的生長位置在腹部及腹部外周。睪丸組織溫度低于體溫，是精子生成的基本保證。睪丸溫度超過所需適宜溫度，生精功能將發(fā)生改變［2］，故可通過給予睪丸熱應激建立生精功能異常的動物模型。

一般能夠建立熱效應的手段包括水浴加熱、激光、紅外線等，但是實驗中主要采用水浴方法，因為其操作簡單、可控性強，不易造成動物其他臟器的損害。Kanter等［3］通過水浴加熱兔睪丸建立不育癥動物模型，睪丸處在43℃的恒溫水浴中30 min后，兔睪丸生精功能異常。通過觀察發(fā)現(xiàn)高溫能夠顯著降低兔睪丸內谷胱甘肽的含量以及超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性。此外，接觸高熱能夠導致睪丸內脂質過氧化作用增強，繼而影響正常精子的生成。Pérez-Crespo等［4］運用同樣的方法，將小鼠置于43℃水浴30 min，隨后將小鼠附睪內的成熟精子進行回收并觀察熱暴露后的精子數量、精子活率、運動軌跡、前向運動精子和精子DNA完整性的變化，發(fā)現(xiàn)瞬間適度高溫能夠導致生殖細胞死亡，精子數量及活力降低，且精母細胞對于熱暴露有更高的敏感性。

1.2 輻射效應

通過對實驗動物生殖器官進行輻射處理，可以得到相應的不育動物模型。輻射處理動物睪丸組織，可使生精細胞及精子DNA鏈發(fā)生斷裂，同時生精小管的正常結構發(fā)生改變，繼而影響生精功能，與此同時，輻射干預加強了促凋亡基因的轉錄，加速精子死亡［5］。體外X射線（4Gy）輻射或體內植入同位素In-114（1.85MBq）污染的俄歇電子，兩種形式的輻射均能造成輸精管內精子數目和睪丸重量的顯著降低，其中In-114的效果更明顯［6］。最新研究發(fā)現(xiàn)利用2.45 Hz微波照射20周齡成年小鼠后，其精子數量及活力顯著降低，表現(xiàn)為生精小管直徑縮短以及曲細精管變性，睪丸內誘導型一氧化氮合酶表達增加［7］。

2 化學因素

2.1 棉酚

棉酚是草棉、樹棉或陸地棉成熟種子、根皮中提取的一種多元酚類物質。有研究表明棉酚能夠對精子活力以及密度造成影響［8］。口飼粗棉籽油能夠使小鼠體內游離棉酚劑量達到14 mg／kg，產生對睪丸的生殖毒性［9］。腹腔內注射劑量為5、10、20 mg／kg的棉酚溶液后，發(fā)現(xiàn)大鼠的精子活力及密度顯著降低，支持細胞自身毒性加強，加速曲細精管變性，大劑量同時能夠影響小鼠肝的正常功能［10］。在造模時應注意棉酚對模型肝功能的損害，選擇未觀察到不良影響的最佳劑量為宜。

2.2 腺嘌呤

腺嘌呤是通過誘發(fā)慢性肝、腎功能損害建立動物模型的常用藥物，可造成雄性大鼠睪丸生精功能障礙，因此腺嘌呤大鼠不育癥動物模型為當今不育癥藥效學及藥理學研究的常見模型之一。以200mg／kg腺嘌呤灌胃30d，觀察發(fā)現(xiàn)服用腺嘌呤后大鼠的精子總數及活力顯著降低，同時腺嘌呤能夠降低血清睪酮含量、抑制類固醇合成及睪丸內皮素-1相關的m RNA表達［11］。但考慮到其具有較強肝腎毒性，應選擇造模最佳劑量及時間。

2.3 雷公藤

雷公藤為衛(wèi)矛科植物雷公藤的根，其提取物雷公藤多苷能夠造成小鼠生殖功能損害。按劑量30 mg／kg口飼雷公藤多苷8周后，SD大鼠的精子密度、活力及精子內Ca2＋濃度均顯著下降［12］。提示雷公藤提取物長期口飼喂養(yǎng)小鼠能夠成功建立動物不育模型。考慮到雷公藤的藥物毒性，在利用雷公藤提取物造模時，應選擇未損傷其他臟器的最佳劑量及時間。

2.4 烏本苷

烏本苷是在非洲或南美洲植物中發(fā)現(xiàn)的一種具有強心作用的甾體化合物，是 Na（＋）／K（＋）-ATP酶（鈉泵）的唯一天然抑制劑［13］。研究發(fā)現(xiàn)烏本苷能夠影響小鼠支持細胞內支持 Na（＋）／K（＋）-ATP酶基因表達的細胞信號傳導，劑量為1μM烏本苷干預會引發(fā)支持細胞外信號調節(jié)激酶和磷脂酰肌醇激酶／絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶磷酸化的增加，與此同時，烏本苷上調了支持細胞周期蛋白D1的表達以及［甲基-（3）H］胸苷的摻入，繼而影響支持細胞正常生理功能，造成生精功能異常［14］。

2.5 甲醛

甲醛具有小鼠生殖細胞毒性，能夠對小鼠生殖細胞造成損傷。研究表明氣體甲醛吸入給藥（10 ppm／1h）35d后，小鼠睪丸內睪酮含量、附睪精子濃度以及精子活力顯著下降，而精子畸形率升高［15］。最新研究發(fā)現(xiàn)，甲醛能夠加速小鼠睪丸組織的自噬作用，表現(xiàn)為睪丸重量和組織學改變，睪丸生精功能下降［16］。甲醛具有較強毒性，因此應用甲醛建立模型的穩(wěn)定性及安全性有待更深層次的研究。

2.6 白消安

白消安主要應用于治療惡性腫瘤，但長期服用可導致體內沉積，抑制生殖干細胞分化，導致生殖功能異常［17］。研究表明單一腹腔注射劑量為5 mg／kg的白消安，就能夠使雄性小鼠生精功能發(fā)生異常，主要表現(xiàn)為睪酮分泌水平下降、睪丸體積縮小以及曲細精管結構發(fā)生變化［18］。當劑量分別調節(jié)到15、30、45 mg／kg時，經過4周白消安干預后，所有劑量組的小鼠生育力喪失，＞95%的精原干細胞在3 d內消失，生育能力以及精原干細胞數量隨著時間增加可逐漸恢復，但是在高劑量白消安干預下恢復受到明顯抑制［19］。

3 內分泌因素

3.1 己烯雌酚

己烯雌酚是人工合成的雌激素，能產生與天然雌二醇相同的藥理作用。研究表明己烯雌酚能夠抑制小鼠生殖功能。選擇剛出生的幼年雄性小鼠皮下注射100ng己烯雌酚，注射后小鼠睪丸內間質細胞、生殖細胞以及多核細胞減少，同時影響下丘腦功能，導致內分泌功能失調［20］。另有研究發(fā)現(xiàn)己烯雌酚能夠干擾小異源二聚體伙伴基因Nr0b2的表達，而該基因的表達能通過調節(jié)生殖細胞進入減數分裂以及睪酮合成來控制睪丸功能［21］。提示在己烯雌酚干預下能夠抑制小鼠睪丸生精，建立不育癥模型。

3.2 炔雌醚和左炔諾孕酮

左炔諾孕酮炔雌醚片為常用的有效避孕藥，應用廣泛。其中主要成分為炔雌醚和左炔諾孕酮，兩者均為人工合成的激素類藥物。研究證實單獨使用炔雌醚或聯(lián)合應用兩者的混合物均會對大鼠生殖功能造成損害，將SD大鼠按重量隨機分組，分別口飼0.33 mg／kg炔雌醚和0.67 mg／kg左炔諾孕酮以及同等劑量的兩種混合物，小鼠睪丸內表現(xiàn)出畸形精子增多、拉長期精子細胞減少以及粗線期精母細胞分化阻滯［22］。

4 環(huán)境因素

環(huán)境化合物在日常生活中應用廣泛，同時在生活環(huán)境中極易接觸，其具有較高生殖毒性，因此對于環(huán)境化合物的研究已引起學者們的廣泛關注，相關研究逐漸增多。

4.1 阿特拉津

阿特拉津的化學名為2-氯-4-二乙胺基-6-異丙胺基-1，3，5-三嗪，屬三氮苯類除草劑。研究表明阿特拉津可作為雄性小鼠的一種內分泌干擾物，影響生殖功能［23］。將阿特拉津按照劑量50 mg／kg灌胃后，發(fā)現(xiàn)小鼠血清睪酮和睪丸內睪酮含量均明顯減少50%；將小鼠體內的間質細胞與232 pg／ml阿特拉津溶液共同培養(yǎng)，間質細胞中睪酮生成減少了35%［24］。近期研究發(fā)現(xiàn)，阿特拉津能夠降低發(fā)育期雄性小鼠睪丸細胞內谷胱甘肽S-轉移酶、谷胱甘肽過氧化物酶、氧化氫酶的活性，同時抑制間質細胞的雄核發(fā)育［25］。提示阿特拉津具有抑制睪丸生精作用，可作為不育癥造模的選擇之一。

4.2 甲氧滴滴涕

甲氧滴滴涕的化學名為1，1，1-三氯-2，2-二對甲氧苯基乙烷，屬有機氯殺蟲劑?？诜竽芨蓴_機體自身的激素分泌，導致生殖功能障礙［26］。通過甲氧滴滴涕的活性代謝產物2-（4-羥基苯基）-2-（4-甲氧基苯基）-1，1，1-三氯乙烷和2，2 -二 （4-羥基苯基）-1，1，1-三氯乙烷觀察甲氧滴滴涕的生殖毒性作用，結果發(fā)現(xiàn)未觀察出不良反應的合適劑量為每天0.6mg／kg，此劑量可損害小鼠生殖功能，同時畸形率未發(fā)生變化［27］。最新研究發(fā)現(xiàn)，在甲氧滴滴涕干預下成年大鼠睪丸早期間質細胞的生成受到抑制，同時隨著時間增加血清睪酮含量下降，并且能夠抑制新生間質細胞內PDGFB mRNA的表達［28］。

4.3 乙烯菌核利

乙烯菌核利的化學名稱為3-（3，5-二氯苯基）-5-乙烯基-5-甲基-2，4-噁唑烷二酮，可作為多種蔬菜水果、植物及草類的殺菌劑。其自身具有抗雄激素樣作用，通過與雄激素受體競爭影響正常雄激素分泌，繼而抑制睪丸生精功能［29］。將成熟的鯽魚培育在三種濃度（100、400、800μg／L）的乙烯菌核利溶劑中，發(fā)現(xiàn)其所產生的影響程度具有劑量依賴性，而抑制過程主要是通過干擾類固醇的生成降低精子質量［30］。

4.4 雙酚A

雙酚A的化學名稱為2，2-二（4-羥基苯基）丙烷，為已知的具有抗雄激素樣化合物，能夠誘導雄性大鼠不育［26］。按照劑量為0.0005～5 mg／kg喂養(yǎng)成年大鼠8周，此濃度的雙酚A未產生全身毒性反應以及明顯的血清激素水平改變，但明顯減少曲細精管內上皮細胞的高度和圓細胞的數量以及精子數量，抑制雄激素受體以及精子外部致密纖維蛋白相關基因的表達［31］。另有研究發(fā)現(xiàn)，分別用劑量0、20和40μg／（kg·day）的雙酚 A干預出生21、35、49d的幼年雄鼠，5周后小鼠睪丸內雌激素受體α表達增加，生殖細胞有絲分裂減慢，精子密度及質量下降，但并不影響生殖細胞印跡基因的甲基化［32］。

5 遺傳因素

越來越多的證據表明，許多情況下的男性不育癥是由基因缺陷所引起［33］。近年來越來越多有關男性不育癥的實驗研究圍繞該方面展開。通過影響基因表達來建立男性不育癥動物模型越來越受到研究者重視。

5.1 磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶基因敲除

細胞內的磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（GPx4）能夠直接減少過氧化磷脂，具有較強的抗氧化作用。將小鼠睪丸精母細胞內GPx4基因特異性敲除后，雄性小鼠附睪上分離的無GPx4精子無法與卵母細胞在體外結合，表現(xiàn)為前向運動能力下降以及線粒體膜電位降低，繼而出現(xiàn)如精子中段發(fā)夾樣鞭毛彎曲和線粒體膨大等精子異常結構［34］。提示特異性敲除雄性小鼠精子內GPx4后表現(xiàn)為活動力嚴重下降，同時精子畸形率顯著提高。

5.2 雄激素受體基因敲除

雄激素和雄激素受體對睪丸發(fā)揮正常功能起著重要的作用，敲除小鼠睪丸細胞的雄激素受體后表現(xiàn)為生殖細胞發(fā)育遲緩以及血清睪酮水平降低，繼而導致不育。特異性敲除小鼠睪丸管周肌樣細胞中雄激素受體基因后，小鼠睪丸呈萎縮狀態(tài)，生殖細胞總數減少，支持細胞內某些基因不能完全表達［35］。提示特異性敲除小鼠睪丸管周肌樣細胞中雄激素受體基因，可使支持細胞功能異常，小管周圍細胞收縮力減弱，影響正常精子發(fā)生和排出，導致小鼠不育。

6 小結

男性不育癥是由多種疾病和（或）因素造成的結果，有高達30%～40%的患者為不明原因［1］，給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)，也推動了眾多的臨床和基礎實驗研究。因此相關的造模方法也有很多種，目前主要分為物理因素、化學因素、內分泌因素、環(huán)境因素、遺傳因素等。使用最廣泛的為化學因素，其優(yōu)勢是成功率高、費用低、造模所需時間短，但也存在不足，如應用化學藥品可能對肝、腎及其他臟器造成損害，形成多臟器損傷的疾病模型，直接影響模型的生物穩(wěn)定性。而且部分化學藥物的使用劑量在相關文獻中不統(tǒng)一，存在重復性差的現(xiàn)狀。物理方法對于生殖系統(tǒng)的損傷針對性較強，但生殖功能受到損害后極易恢復，模型穩(wěn)定性較差，并且干預手段的最佳劑量及時間很難定量。內分泌因素模型給藥途徑與化學方法相似，但研究數據較少，因此有待更多相關方面的動物實驗研究。目前關于環(huán)境化合物的基礎研究越來越多，大量研究發(fā)現(xiàn)許多人工合成并廣泛應用于工業(yè)及農業(yè)的有機化合物均具有較強的生殖毒性，其作用機理與化學因素和內分泌因素相似，但相關研究數據亦較少，考慮到其較強致癌性，劑量、造模時間及給藥途徑仍有待研究。近年來生精相關基因研究成為生殖醫(yī)學領域的熱點，據報道有超過2300組基因在睪丸中表達，其中有相當多的基因影響人類的生殖功能并能導致男性不育癥的發(fā)生［36］，因此基因學將成為未來生殖醫(yī)學領域的研究重點。但基于生精基因造模的操作難度大，尚不能廣泛應用于實驗研究。綜上所述，目前化學方法為主要造模手段，隨著研究的深入以及造模方法的不斷改進，環(huán)境化合物造模以及基因造?；蛟S將代替化學方法，成為未來不育癥動物實驗的主要造模方法。

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