佟雪梅

(北京威泰科生物技術(shù)有限公司研發(fā)部，北京 100070)

大腸癌(CRC)是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率隨年齡而增長(zhǎng)〔1，2〕。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期開(kāi)展規(guī)范化的手術(shù)治療是提高CRC療效的關(guān)鍵〔3〕。近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)被逐漸應(yīng)用于臨床研究等領(lǐng)域，其研究結(jié)果更直接地用于疾病的預(yù)防、診斷和治療,其中二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用最廣泛〔4，5〕。本文通過(guò)研究二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)在CRC與正常腸組織相關(guān)差異表達(dá)蛋白,篩選出CRC的早期診斷標(biāo)志物,從而為CRC的早期診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1一般資料 選擇某院確診為CRC的15例患者，其中男8例，女7例，年齡30～62〔平均(36.20±7.09)〕歲，分別取其手術(shù)切除樣本15例為CRC組，取距腫塊15 cm以上的大腸組織15例為對(duì)照組，標(biāo)本以低溫生理鹽水沖洗干凈，除去污漬和血液，置于液氮冷存?zhèn)溆谩Ｋ胁∪诵g(shù)前均未行化療、放療和其他生物治療。

1.2方法

1.2.1組織標(biāo)本蛋白質(zhì)抽提〔6〕取50 mg組織標(biāo)本在液氮下充分研磨至粉末狀，加入裂解液：6.5 mol/L urea，2%NP，2 mol/L硫脲，1%聚乙二醇辛基苯基醚，100 mol/L二硫蘇糖醇,5 mmol/L苯甲基磺酰氟，4%乙醇胺丙基二甲氨基丙磺酸鹽(CHAPS)，40 mmol/L三羥甲基氨基甲烷，0.5 mmol/L乙二胺四乙酸，2% pharmalyte，0.25 mg/ml核糖核酸酶A 1 mg/ml，胰脫氧核糖核酸酶400 μl，充分混勻，然后置于37℃孵育1 h，取出后再混勻，4℃ 15 000 r/min離心3 min，所得的上清液即為組織總蛋白。最后通過(guò)二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定樣本的蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2組織標(biāo)本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 用2.0 mg/ml的牛血清白蛋白配制出濃度梯度為0.125、0.25、0.5、1、1.5 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在波長(zhǎng)570 nm下用酶標(biāo)儀檢測(cè)各濃度的光密度值。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到直線回歸方程，最后將待測(cè)蛋白樣本的光密度值帶入此方程算出所測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。

1.2.3二維電泳〔7〕參照《雙向電泳原理與方法》：將蛋白樣品(400 μg)與水化液(300 μl)充分混合振蕩后上樣，加入pH梯度干膠系(IPG)持膠槽(避免產(chǎn)生氣泡)，再將IPG膠條去掉保護(hù)膜后，以膠面向下的方式將IPG膠條放入電泳槽進(jìn)行IEF電泳，加上覆蓋液，置于IPGphor等電聚膠儀上，水化和聚焦在20℃自動(dòng)進(jìn)行，總電壓時(shí)間積為52 420 Vh，其中30 V低電壓水化14 h，然后經(jīng)過(guò)500 Vh，1 000 Vh，3 000 V 0.5 h，5 000 V 0.5 h，6 000 V 0.5 h，7 000 V 0.5 h，8 000 V 5 h，最大電流55 μA。電泳結(jié)束后取出膠條、沖洗及平衡。將膠條放于十二烷基硫酸鹽-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)膠筒上進(jìn)行第二向電泳。根據(jù)正負(fù)極標(biāo)志連接好電泳槽和電源，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，先以30 mA恒流慢速電泳20 min(15 mA，根)，20 min后以60 mA恒流電泳，溴酚藍(lán)標(biāo)志線接近凝膠底部時(shí)電泳結(jié)束。

1.2.4凝膠圖案分析〔8〕首先用Labscan掃描軟件和Imagescaner掃描儀對(duì)凝膠進(jìn)行掃描得到相應(yīng)圖像，然后利用PD-quest7.3軟件分別對(duì)結(jié)腸癌和正常腸組織的雙相電泳圖像進(jìn)行校正點(diǎn)檢測(cè)、背景消減與點(diǎn)匹配、1D與2D棱正，進(jìn)而建立平均凝膠，量化得到的蛋白斑點(diǎn)的信息。

1.2.5質(zhì)譜分析〔9〕選取二維電泳圖像分析得到的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，在凝膠上取得這些點(diǎn)，依次進(jìn)行脫色、烷基化、沖洗、脫水至完全干燥。然后依次進(jìn)行酶解、萃取、離心和脫鹽。最后將樣品與基質(zhì)液混合充分后取其混合液點(diǎn)樣于點(diǎn)樣板上，待樣本自然風(fēng)干進(jìn)行質(zhì)譜分析〔10〕。質(zhì)譜分析步驟：將點(diǎn)樣板置于質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析，得到指紋圖案，利用Profound軟件在蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索該指紋數(shù)據(jù)，確定各點(diǎn)所屬蛋白。

1.3檢測(cè)試劑和儀器 固相IPG pH 3～10、裂解液、BCA、牛血清白蛋白、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)、鐵氰化鉀、碘乙酰胺、三氟己酸、胰蛋白酶等(Sigma提供)。離心機(jī)、酶標(biāo)儀、IPGphor等電聚膠儀、SDS-PAGE膠筒、實(shí)驗(yàn)常用儀器等(Sigma提供)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1二維電泳結(jié)果分析 CRC樣本和對(duì)照組樣本均采用二維電泳方法獲得蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜后，另外在相同條件下對(duì)同一蛋白樣品進(jìn)行3次雙向電泳后發(fā)現(xiàn)：蛋白斑點(diǎn)主要聚集在pH 4～8、分子量20～100 kD范圍；CRC組的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為974±28，而對(duì)照組為632±19，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；兩組3塊膠中的蛋白質(zhì)點(diǎn)在其位置上均有較好的重復(fù)性，兩兩間的匹配度最高可達(dá)到90.0%； IEF方向上，大腸癌組的偏差平均值分別為(0.713±0.204) mm，對(duì)照組為(0.582±0.193) mm，兩組在IEF方向上的偏差具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)； SDS-PAGE方向，大腸癌組偏差平均值為(0.977±0.372) mm，對(duì)照組為(1.170±0.412) mm，兩組在SDS-PAGE方向的偏差具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的確定標(biāo)準(zhǔn)為：蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)量與所匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)量總和比值>3，且同組3塊膠圖譜中均出現(xiàn)相同變化的蛋白點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，兩組的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為75.20±18.76。

2.2質(zhì)譜分析結(jié)果 在大腸癌組和對(duì)照組的二維電泳圖譜中，選取其中大腸癌組表達(dá)高于對(duì)照組的蛋白質(zhì)點(diǎn)36個(gè)進(jìn)行質(zhì)譜分析。以Mowse分為基礎(chǔ)概率評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋結(jié)果的質(zhì)量，分值大小表示鑒定蛋白隨機(jī)匹配的可能性，匹配分值大于63說(shuō)明具有顯著性意義。本研究鑒定的36個(gè)點(diǎn)中，質(zhì)譜分析鑒定CRC異常表達(dá)蛋白類型有ACTB protein、annexin Ⅱ、annexinⅣ、APOALPROTEIN、 calreticulin precursor、 fatty acid-binding protein、hepatic、Actin bata、11s regulator, chain B、HSP27、pregnancy-specific glcoprotein、Chaperonin containing TCP 1、Transgelin、glutathione s-transferase、tubulin beta chain、triosephosphate isom erase、serum album in, chain A。

3 討 論

CRC在遺傳因素和環(huán)境的綜合作用下，經(jīng)歷多步驟、多基因及多階段復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。結(jié)直腸上皮細(xì)胞增生-腺瘤-非典型增生-癌-轉(zhuǎn)移癌為CRC發(fā)生發(fā)展的模式。在其發(fā)病的不同時(shí)期，腫瘤細(xì)胞由于基因組改變進(jìn)而產(chǎn)生一些與腫瘤相關(guān)或者一些腫瘤特異的小分子蛋白質(zhì)，另外還可能分泌一些細(xì)胞因子或相關(guān)抗體，這些物質(zhì)釋放到血液成為CRC的相關(guān)血清腫瘤標(biāo)志物〔11〕。CRC目前在我國(guó)惡性腫瘤中列第5位，其發(fā)病率和死亡率呈逐年增高的趨勢(shì)，盡管近年診治水平有明顯提高，但病死率仍居高不下，其主要原因就是CRC很難被早期發(fā)現(xiàn)，大部分患者到中晚期才被確診，從而錯(cuò)過(guò)了手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)〔12〕。因此，研究CRC的發(fā)生機(jī)制、發(fā)現(xiàn)CRC特異性標(biāo)志物及研究其相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)已然成為目前CRC防治的關(guān)鍵問(wèn)題。

在腫瘤生物標(biāo)志物篩選檢測(cè)技術(shù)方面，高通量生物技術(shù)應(yīng)用較為廣泛, 包括基因芯片, 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)/蛋白質(zhì)芯片等〔13〕。蛋白質(zhì)組學(xué)以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白的存在及其活動(dòng)方式為研究對(duì)象，研究的內(nèi)容是識(shí)別及鑒定一種細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)表達(dá)模式〔13〕。其中二維電泳，又稱為二維APGE電泳，結(jié)合了等電聚焦技術(shù)(根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)進(jìn)行分離)以及SDS-PAGE電泳技術(shù)(根據(jù)蛋白質(zhì)大小進(jìn)行分離)，是表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有效手段之一，是目前唯一能將上萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)同時(shí)分離與展示的技術(shù)〔14〕。質(zhì)譜法是利用電磁學(xué)原理，對(duì)荷電分子或亞分子裂片依其質(zhì)量和電荷的比值(質(zhì)荷比，m/z)進(jìn)行分離和分析的方法，在腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)上應(yīng)用廣泛〔12〕。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選CRC發(fā)生發(fā)展相關(guān)蛋白是可行、有效的。

4 參考文獻(xiàn)

1葉任高.內(nèi)科學(xué)〔M〕.第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:1231-4.

2馬曉強(qiáng),李 海,侍明海,等.221例大腸癌臨床分析〔J〕.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008;30(6):756-7.

3呂仙梅,鄭 堅(jiān),朱瑩杰,等.中醫(yī)藥聯(lián)合化療對(duì)大腸癌Ⅱ、Ⅲ期患者生存期的影響〔J〕.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012;32(9):1166-70.

4陳主初.腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展〔J〕.癌癥,2004;23(2):113-7.

5李 峰,關(guān)勇軍,陳主初,等.蛋白質(zhì)組學(xué)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用〔J〕.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2001;28(2):164-7.

6劉志紅,曾 亮,鄧亞平,等.不同臨床分期大腸癌組織的二維電泳圖譜建立及質(zhì)譜分析〔J〕.腫瘤基礎(chǔ)與臨床,2007;20(1):29-32.

7王振玲,王 棟,朱化彬,等.二維電泳分離牛精子蛋白技術(shù)〔J〕.中國(guó)生物工程雜志,2006;26(9):61-6.

8王浩飛,向祖瓊,王益鑫,等.人精子膜蛋白的二維電泳實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華男科學(xué)雜志,2003;9(7):504-6.

9王志武,孫萬(wàn)春,周 悅,等.禽流感病毒H5N1病毒顆粒中雞胚宿主蛋白的質(zhì)譜分析〔J〕.分析化學(xué),2012;40(3):376-80.

10邢加迪,張連海,李晶晶,等.飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在結(jié)直腸癌K-ras基因突變檢測(cè)中的應(yīng)用〔J〕.中華胃腸外科雜志,2013;16(1):80-3.

11王 競(jìng).Artemin和MMP-9在大腸癌中表達(dá)的關(guān)系〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2013;33(8):1769-70.

12李祖國(guó).超分子免疫磁珠定量PCR技術(shù)的建立及大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物的探討〔D〕.廣州:第一軍醫(yī)大學(xué)博士論文,2006.

13韓金祥.腫瘤標(biāo)志蛋白質(zhì)組學(xué)研究及展望〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2008;15(20):1521-3.

14魏曉麗,王 悅.癌蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2008;28(10):1107-10.