肖 靜， 余細勇

(1廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學科學院醫(yī)學研究中心, 廣東 廣州 510080； 2南方醫(yī)科大學藥學院,廣東 廣州 510515)

人體諸多生理功能的發(fā)揮是通過細胞間的信息交換來完成的。目前細胞之間的信息交換涉及的機制較為復(fù)雜，其中比較重要的有分泌生長因子、各種小分子物質(zhì)(多肽類、生物活性脂類和核苷酸)、細胞間接觸和分泌到胞外的基質(zhì)成分等。新近發(fā)現(xiàn)的外泌體 (exosomes)作為一種細胞分泌到胞外的囊泡狀小體，自發(fā)現(xiàn)以來就不斷引起研究者的興趣。近年來對于exosomes參與心血管疾病生理及病理過程的機制探索以及將基于exosomes的研究轉(zhuǎn)化于臨床心臟疾病的診治已成為研究前沿和熱點。

1 Exosomes的基本情況

Exosomes是由多種細胞分泌的雙層模型結(jié)構(gòu)的囊性小泡，直徑為30～100 nm，是已發(fā)現(xiàn)的眾多胞外微粒體的一種。Exosomes由Johnstone等[1]在1987年首次從網(wǎng)織紅細胞的培養(yǎng)上清液中分離出來，之后的研究不斷發(fā)現(xiàn)其它多種類型細胞也可以分泌exosomes, 如: T 細胞[2]、B 細胞[3]、樹突狀細胞[4]以及其它非血源性細胞如腫瘤細胞[5]、施旺細胞[6]，甚至在其它體液中也可見，如尿液[7]。Exosomes的產(chǎn)生機制十分復(fù)雜，涉及到多種因子的調(diào)控作用。目前大多數(shù)研究者比較認同的機制是：細胞在內(nèi)吞時形成的多泡體(multivesicular bodies, MVBs)，在胞外分泌的過程中，MVBs包含的腔內(nèi)囊泡(intralumenal vesicles, ILVs)可以從MVBs的內(nèi)腔釋放到胞外環(huán)境中，而釋放的這些30～100 nm的ILVs就是exosomes[8]。

細胞分泌的exosomes內(nèi)包含許多遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)，exosomes到達胞外后可作用到靶細胞，從而在細胞間信息傳遞以及免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。Exosomes內(nèi)的DNA或RNA可以通過exosomes傳遞到鄰近細胞，引起周圍細胞基因表達的改變[9]；來源于exosomes的微小RNA(microRNA，miR)在干細胞分化的調(diào)控(let-7)、胚胎發(fā)育和器官發(fā)生(miR-1)、造血(miR-181)和腫瘤發(fā)生(miR-17、-18、-19、-19b等)等生理和病理生理過程中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[10]；exosomes內(nèi)的脂質(zhì)對于維持其正常的結(jié)構(gòu)和功能也有重要作用；另外，exosome還含有4次跨膜蛋白超家族(CD9、CD63、CD81、CD82)可以作為識別不同來源exosomes的蛋白分子標記，以及具有功能的熱休克(heat shock protein,HSP)蛋白超家族(HSP70、HSP90)等。

2 Exosomes的生理學功能

自從Raposo等[11]在1996年發(fā)現(xiàn)免疫細胞也可釋放exosomes后，免疫學家就推測exosomes可能具有潛在的免疫調(diào)節(jié)功能，且在后續(xù)研究中逐漸得到證實。有研究者發(fā)現(xiàn)從抗原免疫小鼠的血漿中分離出的exosomes可以抑制Th1型超敏反應(yīng)和Th2型過敏反應(yīng)的應(yīng)答[12]。Wan等[13]發(fā)現(xiàn)激活小鼠的樹突狀細胞可以通過釋放exosomes而直接增加B細胞的效應(yīng)作用。成熟突狀細胞來源的exosomes膜上有縮氨酸耐受的MHCⅠ和MHCⅡ類分子，可以直接和T細胞受體結(jié)合，激活CD4+或CD8+T細胞進而引起一系列的免疫應(yīng)答[14]。

多種細胞來源的exosomes內(nèi)均包含mRNA和miRNA，并且諸多研究已證實它們在exosomes參與細胞之間信息傳遞的作用機制中確實起到重要作用。根據(jù)一個專門收錄與exosomes研究相關(guān)的數(shù)據(jù)庫ExoCarta(http://www.exocarta.org/)中的信息[15]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的exosomes相關(guān)miRNA的種類為764種，包括let-7、miR-1、miR-15、miR-16和miR-181及各種亞型。這些來源于exosomes的miRNA在生物體許多系統(tǒng)均有一定作用。神經(jīng)元來源的exosomes內(nèi)包含豐富的miRNA，這些exosomes可以直接內(nèi)化進入星形膠質(zhì)細胞中并增加miR-124a和谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白1(glutamate transporter 1,GLT1)蛋白的水平；在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞直接轉(zhuǎn)染miR-124a也可以顯著增加GLT1蛋白(但不是mRNA)表達的水平[16]。

3 Exosomes與心血管疾病

在發(fā)現(xiàn)exosomes早期，研究者較多地聚焦于exosomes在腫瘤中發(fā)生發(fā)展機制中的重要作用。許多研究結(jié)果證實了exosomes是參與癌細胞和正常細胞信息交流的重要物質(zhì)，多種細胞因子(如白細胞介素、腫瘤壞死因子超家族等)通過exosomes的攜帶作用進入腫瘤細胞微環(huán)境從而發(fā)揮血管生成及腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等過程。近年，隨著對exosomes研究的深入，已證實exosomes調(diào)控的細胞間信息交流過程也廣泛參與了心血管系統(tǒng)的生理及病理過程，并在心血管疾病發(fā)生發(fā)展機制中扮演重要角色。

心臟球(cardiospheres，CSs)是體外培養(yǎng)心臟組織所獲得的自我聚集為球形的細胞集落。研究發(fā)現(xiàn)心臟球和心臟球來源的細胞(cardiosphere-derived cells，CDCs)均可以分泌exosomes，且這些exosomes和其它微粒體一起在成年心臟組織與異體細胞間的交流中發(fā)揮重要作用[17]，尤其在telocytes(一種在干細胞微環(huán)境中已發(fā)現(xiàn)具有信息傳遞功能的間質(zhì)細胞)及其它常駐性心肌祖細胞(resident progenitor cell)之間[18-19]。Vrijsen等[20]研究證實來源于心肌祖細胞的exosomes在體外抓傷實驗中能夠促進內(nèi)皮細胞的遷移，提升的內(nèi)源性心肌的再生能力。心肌成纖維細胞分泌的exosome能夠在心肌細胞周圍引起特定的效應(yīng)。當用心肌成纖維細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細胞時，會改變神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)從而改變心肌細胞內(nèi)Na+離子通道和內(nèi)向整流K+通道的表達水平[21]。隨后，研究者還發(fā)現(xiàn)心肌細胞exosome能夠向其它某些細胞傳遞DNA和RNA：Waldenstrom等[9]分別用碘化丙啶和吖啶橙示蹤DNA和RNA，在體外將遺傳物質(zhì)標記后的exosome導(dǎo)入成纖維細胞中，孵育3 h后，激光共聚焦顯微鏡結(jié)果提示來源于外生exosome的DNA和RNA已經(jīng)被成纖維細胞內(nèi)化。

除了心肌細胞能夠分泌exosomes之外，內(nèi)皮細胞分泌的exosomes在心血管形成機制中有重要作用。van Balkom等[22]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞來源的exosomes包含的miR-214 在鄰近靶細胞內(nèi)通過沉默毛細血管擴張性共濟失調(diào)突變從而刺激血管生成。主動脈內(nèi)皮細胞所產(chǎn)生的包含HSP-70的exosomes可以選擇性地激活單核細胞，但是在其它類型的內(nèi)皮細胞中未見類似報道[23]。內(nèi)皮細胞exosome來源的HSP70可以募集單核細胞引起炎癥反應(yīng)，提示exosome在細胞炎癥反應(yīng)中起主要作用，對人微血管內(nèi)皮細胞在缺氧和高糖狀態(tài)下產(chǎn)生的exosomes進行指紋分析，發(fā)現(xiàn)其包含1 354種蛋白質(zhì)和1 992種信使RNA，參與了常駐性心肌細胞的胞內(nèi)壓力應(yīng)激反應(yīng)[24]。此外，內(nèi)皮細胞分泌的包含miRNA的微泡參與了內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞共培養(yǎng)時2種細胞之間的信息交流過程，有助于體內(nèi)對抗動脈粥樣硬化、保護血管內(nèi)皮的作用[25]。

此外，大量研究發(fā)現(xiàn)當心肌細胞處在某些病理狀態(tài)(如心肌缺血性損傷等)時，exosomes也參與其中，它或?qū)е缕渌徑毎±砀淖?，或提供某些保護性因子。例如Kuwabara等[26]研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死和心絞痛病人血漿exosomes中miR-1和miR-133a的表達水平較正常人顯著升高。因而心肌細胞的exosomes或可以作為信息傳遞的載體，心肌內(nèi)某致病基因一旦出現(xiàn)表達的改變，將可通過exosomes將這一變化轉(zhuǎn)遞到周圍的細胞。Exosomes內(nèi)所包含的組蛋白是其來源細胞分泌的所有組蛋白中的一部分，有研究提示心肌成纖維細胞分泌的組蛋白可以在體外緩解再灌注心臟的缺血性損傷[27]；但進一步卻發(fā)現(xiàn)，條件培養(yǎng)基的心臟保護性效應(yīng)只有在培養(yǎng)基內(nèi)存在分子量大于50 kD的碎片時才出現(xiàn)。對這一現(xiàn)象可能的解釋是成纖維細胞分泌的exosomes足夠容納分子量在50 kD以上的片段，像血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素1[27]這類的低分子量心肌保護性因子，可以在50 kD大小的碎片中單獨表達，也可以包裝在exosomes之中到達靶細胞后發(fā)揮效應(yīng)。另外，心肌細胞在乙醇、高糖等非正常條件刺激下可以增加exosomes的分泌量[28]，這一現(xiàn)象提示當心肌細胞處于某些病理條件下時，心肌損害的出現(xiàn)可能同其本身所釋放出的exosome有關(guān)。

4 Exosomes對心肌疾病的治療潛能

目前對于心血管系統(tǒng)來源的exosomes功能的研究還處于初始階段，但是exosomes作為缺血性心肌疾病的治療潛能已得到初步證實。

最近，有研究者采用微泡作為藥物傳遞系統(tǒng)，利用exosomes特異定位細胞的能力治療某些疾病[29]，該藥物傳遞系統(tǒng)甚至可以傳遞遺傳物質(zhì)到靶細胞[10]。這個方法與exosomes模擬物不同，后者采用人工合成的exosomes，其內(nèi)容物只包含基本的定位成分，并且將其它內(nèi)源性成分(endogenous cargo)減到最少[30]。這個藥物傳遞系統(tǒng)同目前利用脂質(zhì)體進行藥物傳遞的方法非常相似[31]，但是，相比一般的脂質(zhì)體藥物傳遞系統(tǒng)，exosomes具有靶向特定的細胞甚至細胞亞群的優(yōu)勢。例如，含有外生siRNA的exosomes可以通過血腦屏障傳遞其內(nèi)容物到達特定的神經(jīng)靶細胞、小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞，使這些細胞內(nèi)特定的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)[32]。使用exosomes還可以提高藥效，當exosomes內(nèi)被裝上外源性curcumin(一種消炎藥)，可以觀察到該藥的生物利用度、溶解度及穩(wěn)定性都明顯提高[33]，在由脂多糖誘導(dǎo)的感染性休克的小鼠模型中，exosomes傳遞的curcumin可以減少炎癥細胞因子IL-6和腫瘤壞死因子α的濃度，從根本上提高細胞在感染性休克狀態(tài)下的生存率。類似的策略可以利用exosomes表面的蛋白靶向心肌細胞，以期能夠提高藥物作用的專一性，減少治療副作用。Exosomes作為藥物的傳遞系統(tǒng)克服了藥物生物利用率低的缺點，為靶向性特異治療提供了全新的方法。

近年來，除了作為藥物傳遞體的應(yīng)用價值外，exosomes作為信息載體應(yīng)用于疾病的治療以及在再生醫(yī)學方面的應(yīng)用前景也得到初步體現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)干細胞分泌的exosomes具有心肌保護作用[34]，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分泌的exosomes可以保護心肌組織免受缺血與再灌注的損傷[35]、縮小心肌梗死中梗死心肌的范圍[36]以及急性腎小管損傷的范圍[37]。在豬缺血再灌注模型中，來源于間充質(zhì)干細胞和胚胎干細胞分泌的exosomes也有類似研究發(fā)現(xiàn)，這種細胞產(chǎn)生的exosome可以縮小心肌梗死范圍，提高心功能[38]。Manole等[39]在心梗周圍區(qū)域發(fā)現(xiàn)有來源于telocytes的exosomes出現(xiàn)，提示其可能有潛在的血管生成功能。本課題組近期研究發(fā)現(xiàn)Sca-1+干細胞通過熱休克(42 ℃處理3 h)處理后，其存活率可顯著提高；我們進一步研究發(fā)現(xiàn)熱休克干細胞通過exosomes分泌熱休克因子1(heat shock factor 1)到胞外并作用于處于缺血狀態(tài)的心肌細胞，使心肌細胞凋亡減少，從而顯著改善心功能，這一研究對研發(fā)心肌保護藥物及解決干細胞移植治療心肌梗死的瓶頸問題具有重要臨床意義[40]。另外，在心臟受到損傷時，除了干細胞分泌保護性作用的exosomes外，Chen等[41]研究者證實心肌祖細胞分泌的exosomes也可以保護缺血的心肌細胞不受急性缺血再灌注的傷害，因此心肌祖細胞來源的exosomes治療心臟疾病或同樣具有廣泛的前景。

5 展望

對于缺血性心肌病，干細胞療法具有廣泛的應(yīng)用前景，但是宿主細胞對外來干細胞的排斥以及干細胞進入體內(nèi)后細胞的完整性被破壞是運用干細胞療法主要的困難與挑戰(zhàn)。目前研究熱點正立足于運用exosomes解決干細胞在治療缺血性心臟病中面臨的干細胞存活率問題，以有利于心肌保護性藥物治療靶點的探索和完善。因此，心血管系統(tǒng)exosomes的研究對于了解心臟細胞之間的通訊機制、疾病的發(fā)生發(fā)展過程、探尋心血管疾病潛在的分子標記物以及優(yōu)化心臟疾病的診治均具有重要的臨床意義。此外，通過心臟exosomes的研究技術(shù)與思路，對我們攻克其它難治性疾病(如惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病等)也具有借鑒和指導(dǎo)意義。

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