崔 哲沈光海*

（1 延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000；2 延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉 133000）

柴胡皂苷B2（Saikosaponin B2）對(duì)四氯化碳損傷HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用

崔 哲1沈光海2*

（1 延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000；2 延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉 133000）

目的初步探討柴胡皂苷 B2（SSB2）對(duì)CCl4肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法用CCl4誘肝HepG2細(xì)胞損傷，設(shè)立正常對(duì)照組、CCl4損傷組和不同濃度SSB2保護(hù)組；利用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活力以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率的方法，觀察SSB2對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果MTT檢測(cè)顯示SSB2保護(hù)組細(xì)胞活性明顯高于損傷組，以SSB2濃度為100 μg/mL保護(hù)組細(xì)胞活性最高 ；流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率顯示SSB2保護(hù)組 （終濃度為100 μg/mL）凋亡率明顯低于CC14損傷組，細(xì)胞周期各期細(xì)胞分布比例無明顯變化。結(jié)論SSB2對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

北柴胡；柴胡皂苷B2；HepG2細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；肝保護(hù)作用

為了探討北柴胡中分離得到的SSB2對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞損傷保護(hù)作用，在CCl4損傷的HepG2細(xì)胞模型上，用MTT檢測(cè)細(xì)胞活性和流式細(xì)胞儀分析的方法探討SSB2對(duì)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料：HepG2細(xì)胞株（延邊大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供），ARX300型核磁共振波普儀（德國 Brucker公司產(chǎn)品），RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT（購自Gibco公司），SONRISE-BASIC TECA酶標(biāo)儀（瑞士Sunrise公司產(chǎn)品），F(xiàn)AC Scan型流式細(xì)胞檢側(cè)儀（美國BD公司產(chǎn)品）。

1.2 方法

1.2.1 提取分離：取北柴胡干燥根2.0 kg，用乙醇室溫提取3次，每次7 d，減壓濃縮得浸膏153.0 g。將浸膏懸浮于水中，依次用CH2Cl2、EtOAc、BuOH萃取，其中BuOH層減壓濃縮后得到浸膏10.5 g，將BuOH浸膏10 g上正、反相硅膠柱層析、LH-20柱層析及甲醇重結(jié)晶得到白色粉末25.0 mg，其核磁共振數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[1]報(bào)道SSB2數(shù)據(jù)一致，確定此化合物為SSB2。

1.2.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)：含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)。當(dāng)匯合度95%以上時(shí)，行細(xì)胞傳代分組試驗(yàn)。

1.2.3 CCl4損傷液制備：DMSO與CCl4以物質(zhì)的量比1∶2混勻，加入到RPMI 1640培養(yǎng)液中（最終濃度為0.4 μmol/μL），得到CCl4混懸液，4 ℃冰箱保存。用前震蕩后使用。

1.2.4 分組實(shí)驗(yàn)：設(shè)正常對(duì)照組、CCl4損傷組和SSB2損傷保護(hù)組。正常對(duì)照組不做處理；損傷組加入CCl4混懸液（最終濃度為6 μmol/mL）；SSB2損傷保護(hù)組分五組SSB2濃度分別為（50、100、150、200、300 μg/mL），于CCl4損傷前12 h加SSB2。三組細(xì)胞均于37 ℃、5% CO2靜置培養(yǎng)（飽和濕度）。

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：將HepG2細(xì)胞以5×104/mL接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。培養(yǎng)12 h后，保護(hù)組加入不同濃度的SSB2，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，加入CCl4（濃度最終為6 μmol/mL），正常對(duì)照組不做處理。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。損傷2 h后加入5 mg/mL的MTT 20 μL，放人CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出培養(yǎng)板，小心吸去培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO，振搖至MTT結(jié)晶溶解后，用全自動(dòng)酶聯(lián)儀測(cè)定各孔吸光度（OD值）（測(cè)試波長(zhǎng)570 nm）。并計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率：OD實(shí)驗(yàn)/OD對(duì)照×100%（以空白組OD值調(diào)零）。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活性：HepG2細(xì)胞以×104個(gè)/mL接種于培養(yǎng)瓶中，隨機(jī)分為三組（對(duì)照組、保護(hù)組、損傷組），每組2瓶。細(xì)胞培養(yǎng)48 h，換液，每瓶精確定量加入4.0 mL培養(yǎng)液，保護(hù)組加入SSB2（濃度最終為100 μg/mL）。靜置培養(yǎng)12 h，損傷組和保護(hù)組加入CCl4（濃度最終為6 μmol/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，分別收集各瓶培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶消化，加入原培養(yǎng)液吹打分散細(xì)胞，1000 rpm/min離心8 min收集細(xì)胞.PBS清洗3次后，用500 μL PBS懸浮細(xì)胞，加入含10 μg/mL的RNase的PI，4 ℃染色30 min，經(jīng)200目過濾后上機(jī)檢測(cè). 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MTT檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：保護(hù)組OD值明顯高于損傷組，SSB2 100 μg/mL組OD值達(dá)最高峰，以后隨著SSB2濃度的增加，OD值下降其保護(hù)作用與劑量和作用時(shí)間相關(guān)。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：正常組細(xì)胞凋亡率為 0，損傷組凋亡率為40.28%，損傷保護(hù)組（SSB2濃度為100μg/mL）凋亡率為9.02%。各組細(xì)胞G1、G2、S期細(xì)胞分布變化很小，SSB2對(duì)CCl4損傷HepG2細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，對(duì)細(xì)胞周期沒有影響。

3 討 論

北柴胡（Bupleurum Chinense DC.）為傘形科（Umbelliferae）柴胡屬植物，具有和表解里及疏肝理氣之功效[2]。北柴胡主要有效成分有柴胡皂苷、柴胡醇、揮發(fā)油、三萜苷類及黃酮類等[3]，大量藥理與臨床研究證明SSB2具有多種藥理活性，具有抗炎、細(xì)胞毒、增強(qiáng)免疫、抑制脂肪分解、刺激PGE2的合成等多種作用[4,5]。目前，SSB2對(duì)肝細(xì)胞損傷保護(hù)作用方面的研究很少，HepG2細(xì)胞株與人正常肝細(xì)胞有許多共同生理功能，是較理想的肝細(xì)胞替代物。因此，本實(shí)驗(yàn)以HepG2細(xì)胞株為研究對(duì)象，在CCl4損傷的HepG2細(xì)胞模型上初步探討SSB2對(duì)肝細(xì)胞損傷保護(hù)作用研究.

本研究結(jié)果表明，SSB2對(duì)CCl4損傷具有顯著的保護(hù)作用；流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，SSB2保護(hù)組細(xì)胞凋亡率較損傷組下降77.59%，對(duì)細(xì)胞周期影響很小，MTT比色分析細(xì)胞活性結(jié)果顯示，保護(hù)組細(xì)胞活性顯著大于損傷組。提示SSB2對(duì)CCl4導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用，SSB2最佳保護(hù)濃度為100 μg/mL，為進(jìn)一步開發(fā)利用北柴胡資源和研究SSB2對(duì)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用和機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 劉沁舡,譚利.柴胡屬皂苷近十年研究概況[J].中國中藥雜志,2002, 27(1):7.

[2] Delectis Florae Reipublicae Poularis Sinicae,Agendae Academiae Sinicae Edita.Flora reipublicae popularis sinica[M]. Tomus55.Beijing:Science Press,1979:7.

[3] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(下冊(cè))[M].上海:上海人民衛(wèi)生出版社,1977:3763.

[4] Tsaiy J,Chen IL,Horng LY,et al.Induction of differention in rat C6 glioma cells with Saikosaponins [J].PhytotherRes,2002,16(2): 117.

[5] 謝東浩,蔡寶昌.柴胡皂苷類化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,23(1):63-65.

R282

B

1671-8194（2014）22-0082-02

吉林省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（編號(hào)：2010-152）

*通訊作者