利用CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速、經(jīng)濟(jì)的大鼠條件基因敲除技術(shù)

在2014年第1期的Cell Research雜志上發(fā)表了一篇利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行大鼠條件基因敲除技術(shù)的技術(shù)性論文（Ma，et al.，Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9，Cell Research（2014）24：122-125.），這篇論文利用CRISPR/Cas9在靶基因的特定外顯子產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，同時(shí)提供一個(gè)環(huán)形質(zhì)粒模板，該質(zhì)粒包含兩端被loxP位點(diǎn)標(biāo)記的、且與被打斷外顯子相同的DNA片段。在受精卵內(nèi)同源重組修復(fù)系統(tǒng)（homologous recombination repair pathway）的作用下，可實(shí)現(xiàn)高效率的靶基因loxP位點(diǎn)標(biāo)記，從而用于大鼠的條件性基因敲除。論文中利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了三個(gè)甲基化酶基因（Dnmt1，Dnmt3a，Dnmt3b）loxP位點(diǎn)標(biāo)記，效率高達(dá)30％，使得制備一個(gè)含loxP位點(diǎn)標(biāo)記大鼠的周期僅2～3個(gè)月，成為目前為止最經(jīng)濟(jì)、快速的大鼠條件基因敲除技術(shù)。

美國(guó)科學(xué)家在2004年就預(yù)測(cè)，大鼠將“回歸實(shí)驗(yàn)室”，并成為生理、行為、代謝、藥物等方面研究的主要?jiǎng)游锬Ｐ汀Ｓ捎诖笫驟S細(xì)胞培養(yǎng)條件的限制，基于大鼠ES細(xì)胞的經(jīng)典基因打靶技術(shù)一直沒有成為常態(tài)化的技術(shù)。但是基因組編輯技術(shù)如鋅指核酶（ZFNs）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子（Talens）技術(shù)不需要通過ES細(xì)胞打靶環(huán)節(jié)，可以直接通過原核注射的方式實(shí)現(xiàn)目的基因的突變，極大的縮短了建立基因敲除動(dòng)物模型的時(shí)間，拓寬了基因修飾的物種范圍。相對(duì)于ZFNs和Talens，近年發(fā)展的CRISPR/Cas9技術(shù)在操作的簡(jiǎn)便性、實(shí)驗(yàn)周期、效率等方面更有優(yōu)勢(shì)，Ma，et al.開發(fā)的大鼠條件基因敲除技術(shù)將為醫(yī)藥研究領(lǐng)域大鼠研究的有利工具。

（馬元武張連峰）

研究報(bào)告