王艷，王茜

周圍神經(jīng)損傷在臨床上較常見(jiàn)，占全部創(chuàng)傷的1.5%～4%[1]。雖然比例較小，但神經(jīng)損傷會(huì)引起嚴(yán)重的肢體功能障礙，主要以運(yùn)動(dòng)障礙、感覺(jué)障礙和營(yíng)養(yǎng)障礙為主，有較高的致殘率[2]。因此是臨床治療和康復(fù)治療急需解決的課題，同時(shí)也是神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的熱點(diǎn)問(wèn)題。周圍神經(jīng)損傷部位及程度不同，所產(chǎn)生的臨床癥狀也不盡相同；且因周圍神經(jīng)解剖和功能上的特殊性，選擇適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立方法，對(duì)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)研究有著深遠(yuǎn)的影響。本文總結(jié)實(shí)驗(yàn)中常用的幾種模型建立方法，并對(duì)目前有關(guān)周圍神經(jīng)損傷動(dòng)物模型的建立中存在的問(wèn)題進(jìn)行討論。

1 卡壓傷模型

周圍神經(jīng)卡壓傷在周圍神經(jīng)損傷中比較常見(jiàn)。嚴(yán)重卡壓傷可導(dǎo)致局部血供受限，繼而引起神經(jīng)損傷段軸索連續(xù)性中斷。此種軸索斷裂傷尚可保持一個(gè)完整的神經(jīng)內(nèi)膜管，損傷平面遠(yuǎn)端軸突發(fā)生潰變，但因保留了神經(jīng)內(nèi)膜管，有利于神經(jīng)軸索在神經(jīng)內(nèi)膜管有規(guī)則地再生，并可順利到達(dá)其支配的靶器官和組織，恢復(fù)原有機(jī)能，一般情況預(yù)后良好[3]。擠壓傷模型常選取此種損傷程度，即SunderlandⅡ度損傷[4]。

1.1 急性神經(jīng)卡壓模型

1.1.1 鉗夾 廖維靖等[5]于20世紀(jì)90年代初，選取體質(zhì)量200～250 g雌性Wsitar鼠，采用Hasegawa的方法[6]，用改良的持針器壓至第3格，持續(xù)5 min。持針器表面銼平，中后部銼凹，尖端呈梯形，測(cè)得面積約4.4 mm2，持針器壓至第3格時(shí)，尖端壓強(qiáng)為0.63 kg/mm2。該實(shí)驗(yàn)介紹了模型建立的操作過(guò)程，但是沒(méi)有表述神經(jīng)損傷的具體程度。90年代中后期，廖維靖等[7]按文獻(xiàn)[5]的方法取大鼠左后肢近中段坐骨神經(jīng)，距膝2.4 cm處用改良持針器鉗夾神經(jīng)，持續(xù)5 min，造成SeddonⅡ類損傷。鉗夾處可見(jiàn)神經(jīng)菲薄。損傷點(diǎn)用1號(hào)絲線輕輕結(jié)扎，以期使神經(jīng)損傷較單純鉗夾損傷重。該實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)模型的神經(jīng)損傷程度定性但沒(méi)有定量，此外1號(hào)線結(jié)扎損傷的程度不能被量化。

王維等在建立鼠坐骨神經(jīng)損傷模型時(shí)，于距坐骨結(jié)節(jié)6～8 mm處用同一把新的17 cm長(zhǎng)止血鉗尖端鉗夾神經(jīng)10 s，壓強(qiáng)為21.95 kPa(以杠桿等效力測(cè)定法測(cè)定)，神經(jīng)挫壓長(zhǎng)度為2 mm[8]。鉗夾后見(jiàn)坐骨神經(jīng)變菲薄，將神經(jīng)放回原位，于神經(jīng)損傷點(diǎn)處用9-0無(wú)創(chuàng)尼龍線標(biāo)記。30 min后檢測(cè)大鼠傷側(cè)坐骨神經(jīng)動(dòng)作電位潛伏期、波幅，當(dāng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度降至10 m/s以下時(shí)認(rèn)為坐骨神經(jīng)軸索及髓鞘斷裂或受到損傷，證實(shí)造模成功[9]。該實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)之處在于將模型損傷程度進(jìn)行定量分析，且提出診斷依據(jù)；于神經(jīng)損傷點(diǎn)處用9-0號(hào)無(wú)創(chuàng)尼龍線不是為加重?fù)p傷程度，而是用于標(biāo)記，這為實(shí)驗(yàn)取材奠定好基礎(chǔ)。但在用尼龍線標(biāo)記時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意松緊度，過(guò)緊會(huì)加重?fù)p傷程度，過(guò)松時(shí)尼龍線很容易向遠(yuǎn)端滑脫。

1.1.2 硅膠管擠壓 韓清民等[10]參照Mackinnon等[11]所設(shè)計(jì)的方法，并加以改良，建立坐骨神經(jīng)急性擠壓傷模型。實(shí)驗(yàn)取鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)，游離并顯露坐骨神經(jīng)，將長(zhǎng)10 mm、內(nèi)徑0.75 mm的硅膠管縱向切開(kāi)一邊，套住坐骨神經(jīng)，用6-0號(hào)尼龍線縫合，將坐骨神經(jīng)直徑從1.2 mm縮窄到0.75 mm，造成坐骨神經(jīng)(10 mm長(zhǎng))環(huán)形擠壓。術(shù)后大鼠置于安靜、溫暖、避強(qiáng)光環(huán)境喂養(yǎng)。24 h后切開(kāi)原切口，拆除硅膠，即形成坐骨神經(jīng)急性擠壓傷模型。該實(shí)驗(yàn)操作難度較高，需要高精度測(cè)量?jī)x器及熟練的操作手法，且24 h后拆除硅膠，又會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成二次損傷。

1.1.3 氣囊擠壓 張立寧等于兔股骨中段后外方尋找并鈍性分離出脛神經(jīng)，在脛神經(jīng)進(jìn)入小腿三頭肌近1 cm處，用一種新式氣囊壓迫脛神經(jīng)2 min，氣囊壓力為3 kPa，造成長(zhǎng)8 mm的神經(jīng)擠壓傷[12]。損傷神經(jīng)HE染色，光鏡下觀察，判斷神經(jīng)損傷程度為SunderlandⅢ度。在損傷部位用1-0號(hào)手術(shù)線固定于神經(jīng)外膜做標(biāo)記。該實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于可通過(guò)控制氣壓的強(qiáng)弱，控制所需的神經(jīng)損傷程度，但氣囊的選材尚待商榷，并且氣囊置于脛神經(jīng)進(jìn)入小腿三頭肌近1 cm處時(shí)，應(yīng)盡量避免牽拉損傷。造成SunderlandⅢ度損傷，由于損傷程度較重，實(shí)驗(yàn)周期可能要相對(duì)較長(zhǎng)。

1.2 慢性神經(jīng)卡壓傷模型

Koda等認(rèn)為急性神經(jīng)性疼痛在臨床準(zhǔn)確診斷不現(xiàn)實(shí)[13]。在研究延遲細(xì)胞集落刺激因子引起的機(jī)械觸誘發(fā)痛對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)的治療效果時(shí)，Koda等選用成年雌性Sprague-Dawley大鼠制作坐骨神經(jīng)慢性擠壓傷模型以治療神經(jīng)性疼痛。

楊米雄等[14]參照O'Brien[15]設(shè)計(jì)的大鼠坐骨神經(jīng)慢性卡壓模型，取右側(cè)臀部斜切口，游離出坐骨神經(jīng)，暴露其長(zhǎng)度約2.5 cm，測(cè)量坐骨神經(jīng)直徑約1.2 cm，將事先準(zhǔn)備消毒好的內(nèi)徑1.2 cm、外徑5.0 cm，改制的硅膠管套在梨狀肌下緣1.0 cm處的坐骨神經(jīng)上，結(jié)扎固定造成坐骨神經(jīng)慢性卡壓傷。硅膠管不取出，避免了模型的二次損傷。但實(shí)驗(yàn)并未具體說(shuō)明卡壓壓力的大小、卡壓具體時(shí)間、神經(jīng)卡壓后的損傷情況，以及硅膠管對(duì)神經(jīng)的影響情況，并且還應(yīng)注意硅膠管植入后的抗炎和抗排異反應(yīng)。

陳曄凌等[16]參照Grace等的方法[17]，建立分級(jí)坐骨神經(jīng)縮窄動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠，將坐骨神經(jīng)主干游離約8 mm，用4-0號(hào)鉻制羊腸線環(huán)繞坐骨神經(jīng)主干做疏松的單結(jié)環(huán)扎，使單結(jié)剛好能沿神經(jīng)上下滑動(dòng)。此種模型建立方法簡(jiǎn)單易行，但損傷程度不能定量，每個(gè)模型的神經(jīng)損傷程度可能會(huì)輕重不一，且在實(shí)驗(yàn)期間疏松的單結(jié)環(huán)扎可能松解并脫落而造成實(shí)驗(yàn)失敗。

2 牽拉傷模型

Fullarton等選用山羊建立模型，先用兩把緊鄰著的Dunhill鉗鉗夾神經(jīng)造成擠壓傷，再牽拉至5 mm，然后持續(xù)性牽拉神經(jīng)30 s，使?fàn)坷紊窠?jīng)最終長(zhǎng)11.5 mm，建立山羊臂叢神經(jīng)牽拉傷的模型[18]。他們主要對(duì)牽拉傷神經(jīng)修補(bǔ)時(shí)間及方法進(jìn)行研究。山羊較為溫順，且神經(jīng)較粗大，便于實(shí)驗(yàn)操作與觀察，但由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較為昂貴，不能夠廣泛應(yīng)用；且神經(jīng)損傷屬擠壓與牽拉的復(fù)合損傷，并未具體說(shuō)明損傷程度。

周翠屏等借鑒Fullarton等牽拉傷模型制作方法并進(jìn)行改良，成功建立坐骨神經(jīng)牽拉傷模型[19]。采用側(cè)臥位以便于充分暴露坐骨神經(jīng)，鈍性分離，游離坐骨神經(jīng)主干，用兩把無(wú)齒輸精管分離鉗分別鉗夾坐骨神經(jīng)主干，兩把鉗相距0.5 cm，為盡量減少鉗夾對(duì)神經(jīng)的損傷作用，分離鉗僅扣住一齒；均勻用力向兩側(cè)分離兩把分離鉗，將其間的神經(jīng)牽拉到1.0 cm，持續(xù)牽拉30 s，此時(shí)可見(jiàn)神經(jīng)被牽拉變細(xì)長(zhǎng)，松開(kāi)鉗子，逐層縫合。病理顯示造成周圍神經(jīng)SunderlandⅢ度損傷[20]。該實(shí)驗(yàn)操作易行，不足之處是造成的損傷為卡壓和牽拉的復(fù)合損傷，操作中可能對(duì)神經(jīng)外膜造成損傷，損傷程度較大。

由于神經(jīng)根軸突無(wú)周圍神經(jīng)軸突所具有的抗?fàn)可熳饔玫呢S塔納條紋(fontana)，當(dāng)暴力牽拉周圍神經(jīng)時(shí)，神經(jīng)根受到暴力牽拉作用超過(guò)其彈性范圍就會(huì)引起結(jié)構(gòu)的變化；神經(jīng)根與外周神經(jīng)相比缺少神經(jīng)外膜和束膜的保護(hù)，損傷?？衫奂吧窠?jīng)根，所以更容易受到牽拉的損傷[21]。因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要使神經(jīng)受到牽拉，首先要固定被牽拉神經(jīng)的兩端，但這樣不可避免地造成神經(jīng)兩端的卡壓傷。這種方法均會(huì)造成神經(jīng)的復(fù)合性損傷，損傷程度較大，并且不容易對(duì)神經(jīng)的損傷定性與定量測(cè)量。對(duì)于建立神經(jīng)牽拉傷的模型的方法，尚有待于繼續(xù)研究。

3 離斷傷模型

神經(jīng)干完全斷裂，斷裂兩端完全分離，或僅以細(xì)小的纖維化組織形成瘢痕條索相連，結(jié)果是損傷神經(jīng)所支配的運(yùn)動(dòng)肌、感覺(jué)神經(jīng)和交感神經(jīng)功能完全喪失，即SunderlandⅤ度損傷。此時(shí)受損神經(jīng)支配區(qū)還會(huì)出現(xiàn)植物神經(jīng)功能障礙，表現(xiàn)為患區(qū)皮膚汗腺、皮脂腺分泌功能障礙[22]。離斷周圍神經(jīng)，通過(guò)選擇性切斷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)或感覺(jué)神經(jīng)的方法來(lái)模擬一個(gè)合理、有效、結(jié)果可靠的動(dòng)物模型，可為失神經(jīng)支配區(qū)病理變化及其影響因素的相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。

趙磊等在大鼠選擇性神經(jīng)損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?shí)驗(yàn)中選取Sprague-Dawley大鼠，①切斷左側(cè)L4～L6神經(jīng)根前根或后根：麻醉狀態(tài)下，取俯臥位固定，前后根切斷組于背部作后正中L3～S1縱切口，顯露左側(cè)腰椎后結(jié)構(gòu)，咬除關(guān)節(jié)突與部分椎板，暴露L4～L6神經(jīng)根。直視下切斷并切除前根或后根1 cm。②坐骨神經(jīng)切斷：于左側(cè)大腿后外側(cè)作弧形切口，顯露坐骨神經(jīng)干，追蹤至梨狀肌下緣5 mm處，切斷并切除1 cm；兩斷端各自翻轉(zhuǎn)180°，分別固定于臀肌及股二頭肌肌膜上，避免神經(jīng)間的自然生長(zhǎng)[23]。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)切斷前根、后根及坐骨神經(jīng)，比較選擇性神經(jīng)損傷所造成的不同結(jié)果，這為研究脊神經(jīng)L4～L6神經(jīng)前根、后根及坐骨神經(jīng)受損后，受損神經(jīng)支配區(qū)域的研究提供依據(jù)。

Isaacs等將12只Sprague-Dawley大鼠部分切斷(2/3)左側(cè)脛神經(jīng)。8周后，測(cè)試雙側(cè)腓腸肌、比目魚(yú)肌和屈趾長(zhǎng)肌最大等長(zhǎng)收縮力，之后切除肌肉并稱重。結(jié)果顯示，患側(cè)與健側(cè)對(duì)比只有腓腸肌肌肉在統(tǒng)計(jì)學(xué)上較弱(P＜0.05)。沒(méi)有患側(cè)與健側(cè)之間的肌肉重量差異[24]。此實(shí)驗(yàn)通過(guò)神經(jīng)對(duì)肌肉的營(yíng)養(yǎng)支持，證明了脛、腓神經(jīng)所支配的肌肉，為脛、腓神經(jīng)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。

王宇博等在不同長(zhǎng)度神經(jīng)片段串聯(lián)再生室對(duì)兔坐骨神經(jīng)再生的影響中，分別設(shè)置自體神經(jīng)片段串聯(lián)再生室4 mm組、6 mm組、8 mm組和自體神經(jīng)移植組。術(shù)后16周觀察顯示，6 mm組和8 mm組優(yōu)于4 mm組，且效果都近似于自體神經(jīng)移植，但6 mm組節(jié)省神經(jīng)，是最為適宜的自體神經(jīng)片段長(zhǎng)度[25]。此實(shí)驗(yàn)為神經(jīng)離斷適宜長(zhǎng)度提供參考。

神經(jīng)離斷傷造模方法也較多地應(yīng)用于神經(jīng)損傷的組織工程學(xué)研究。王曉亮等在應(yīng)用人工神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究中，切除坐骨神經(jīng)造成5 mm損傷，借助手術(shù)顯微鏡，鏡下縫合人工神經(jīng)于神經(jīng)外膜上，并使神經(jīng)兩斷端分別進(jìn)入長(zhǎng)約9 mm的導(dǎo)管內(nèi)約2 mm，術(shù)后5周觀察變化[26]。此種造模方法不僅為周圍神經(jīng)完全離斷后的治療提供新的思路，并且在實(shí)驗(yàn)中采用顯微鏡下操作，使實(shí)驗(yàn)更加精密。但實(shí)驗(yàn)的周期略短，不利于臨床療效的判斷。

4 實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物模型的常見(jiàn)問(wèn)題

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中總會(huì)遇到諸多問(wèn)題，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。其中常見(jiàn)有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自噬現(xiàn)象，原因可能是由于神經(jīng)損害后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)障礙、感覺(jué)神經(jīng)功能障礙、感覺(jué)缺失后肢體反復(fù)的機(jī)械損傷。坐骨神經(jīng)干受損后，遠(yuǎn)端的大部分肢體組織失去神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及皮膚感覺(jué)，因此術(shù)后肢體遠(yuǎn)端出現(xiàn)關(guān)節(jié)僵硬、皮膚潰瘍，部分動(dòng)物甚至自噬或相互撕咬；經(jīng)久不愈的肢體潰瘍也嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)檢測(cè)[19]，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫落從而影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)盡量分籠飼養(yǎng)，及時(shí)更換墊料，對(duì)于肢體潰瘍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)及時(shí)清創(chuàng)以保證潰瘍面積不再擴(kuò)大，并行抗炎治療。

5 小結(jié)

在臨床中，神經(jīng)卡壓傷較為常見(jiàn)，同時(shí)關(guān)于神經(jīng)卡壓傷的實(shí)驗(yàn)研究也是熱點(diǎn)問(wèn)題，但神經(jīng)損傷模型的神經(jīng)損傷定量分析尚有待于進(jìn)一步研究，神經(jīng)卡壓傷的實(shí)驗(yàn)研究是難點(diǎn)問(wèn)題。

在周圍神經(jīng)卡壓傷模型的制作過(guò)程中，由于慢性卡壓傷模型的設(shè)計(jì)存在諸多問(wèn)題，而急性卡壓傷模型在設(shè)計(jì)過(guò)程中所遇到的問(wèn)題不斷被完善，因此急性周圍神經(jīng)卡壓傷模型在實(shí)驗(yàn)中多被采用。其中因鉗夾傷操作簡(jiǎn)單易行，現(xiàn)已被廣泛認(rèn)可與應(yīng)用。王維等以杠桿等效力測(cè)定法測(cè)定一把新的17 cm長(zhǎng)止血鉗尖端壓強(qiáng)為21.95 kPa，使鉗夾損傷程度更加有據(jù)可循。但實(shí)驗(yàn)中神經(jīng)損傷程度的定量仍存在急需解決的問(wèn)題，如神經(jīng)損傷時(shí)所受到的鉗夾力一定，那么鉗夾不同時(shí)間所造成的具體損傷程度，還應(yīng)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡釋說(shuō)明。

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