（蘭州市西固區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730000）

弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白6（GRA6）的研究進(jìn)展

王學(xué)儉

（蘭州市西固區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730000）

致密顆粒是由弓形蟲(chóng)致密顆粒細(xì)胞器分泌的一類(lèi)具有免疫活性的蛋白質(zhì)，它們?cè)诠蜗x(chóng)的入侵，蟲(chóng)體在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活和繁殖方面起著重要作用。本文就致密顆粒蛋白6的分子結(jié)構(gòu)、在蟲(chóng)體入侵中的作用、蟲(chóng)體基因分型以及在弓形蟲(chóng)病診斷和疫苗研制等方面的研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。

弓形蟲(chóng)；致密顆粒蛋白6；入侵；診斷；疫苗研制

弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）是一種重要的機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)，可寄生在多種哺乳動(dòng)物（包括人）的有核細(xì)胞中，由其引發(fā)的弓形蟲(chóng)病在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，給人類(lèi)健康和畜牧業(yè)發(fā)展造成了巨大的損失。致密顆粒蛋白（dense granule protein，GRA）是弓形蟲(chóng)體內(nèi)重要的代謝分泌抗原，已知的致密顆粒蛋白有10種，在弓形蟲(chóng)病的診斷及免疫預(yù)防中存在潛在價(jià)值。而致密顆粒蛋白6由于其存在于速殖子和緩殖子中，與蟲(chóng)體在細(xì)胞內(nèi)寄生、發(fā)育密切相關(guān)，近年來(lái)逐漸被人們所關(guān)注[1]，現(xiàn)將它的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展?fàn)顩r綜述如下：

1 GRA6的分子結(jié)構(gòu)特征

GRA6無(wú)內(nèi)含子，單拷貝，基因序列長(zhǎng)為1632 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?35 bp，有兩個(gè)起始密碼子均可以作為起始密碼，但第一個(gè)密碼子更適合作為翻譯的起始點(diǎn)。編碼230個(gè)氨基酸，中部疏水區(qū)側(cè)翼有兩個(gè)親水區(qū)，含有4組與GRA5蛋白同源的氨基酸。C-末端親水區(qū)含24%的甘氨酸和29%的酸性殘基，但N末端結(jié)構(gòu)域并不符合信號(hào)肽特征。有一個(gè)潛在的N-糖基化點(diǎn)位于殘基74位，含2個(gè)疏水區(qū)域，其中一個(gè)疏水區(qū)域位于偏向N端，另一個(gè)疏水區(qū)域位于中央處，具有跨膜結(jié)構(gòu)域[2-3]。Lecordier等[4]把全部GRA6的開(kāi)放閱讀框序列導(dǎo)入表達(dá)載體pGEX，得到低表達(dá)量的不溶性融合蛋白，并又設(shè)計(jì)不同的引物，分別從弓形蟲(chóng)GRA6基因上擴(kuò)增基因片段，導(dǎo)入表達(dá)載體pGEX，然后在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)、得到位于N端親水區(qū)域蛋白抗原和位于C端親水區(qū)域蛋白抗原，而只有編碼N端重組抗原能被弓形蟲(chóng)感染人的血清所識(shí)別，表明GRA6 N端多肽含有被B淋巴細(xì)胞識(shí)別的抗原表位。GRA6與GRA5之間存在一定氨基酸序列上的同源性，因此有血清學(xué)上的交叉反應(yīng)。

2 GRA6在弓形蟲(chóng)入侵中的作用

在弓形蟲(chóng)侵染脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中連續(xù)觀察到微線體、棒狀體和致密顆粒蛋白的出現(xiàn)[5-6]。弓形蟲(chóng)附著于宿主細(xì)胞引起頂端釋放微線體蛋白MIC2，接著宿主細(xì)胞的胞漿膜內(nèi)褶，釋放棒狀體蛋白R(shí)OP1，形成納蟲(chóng)泡。致密顆粒是頂復(fù)門(mén)所特有的分泌細(xì)胞器，在入侵后不久，致密顆粒蛋白被大量的分泌入納蟲(chóng)泡中。盡管存在很多疏水區(qū)域，它們?nèi)匀灰钥扇艿途畚锏男问竭M(jìn)入納蟲(chóng)泡，并且穩(wěn)定的與納蟲(chóng)泡膜相連。GRA4和GRA6在致密顆粒中初級(jí)包裝為可溶性蛋白質(zhì)，接著釋放入納蟲(chóng)泡。而GRA6主要由疏水作用來(lái)進(jìn)行的，該蛋白質(zhì)以磷酸化形式出現(xiàn)提示其同膜網(wǎng)絡(luò)間關(guān)聯(lián)的增加。GRA4、GRA6和GRA2相互作用，形成一個(gè)多聚體復(fù)合物，便于同泡內(nèi)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定地關(guān)聯(lián)，該蛋白質(zhì)多聚體的形成，依賴(lài)于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用和疏水作用，它還可能參與納蟲(chóng)泡內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。

Braun L等[7]用帶有HA-FLAG標(biāo)簽的GRA2和GRA5蛋白與敲除GRA2和GRA5基因的弓形蟲(chóng)作用，再用親和層析純化，結(jié)果顯示在弓形蟲(chóng)和納蟲(chóng)泡的可溶部分內(nèi)，GRA2-HA-FLAG 和GRA5-HA-FLAG和GRA6、GRA3相結(jié)合。這說(shuō)明在致密顆粒中，GRA6、GRA2、GRA3、GRA5等結(jié)合在一起，通過(guò)將疏水區(qū)域包埋在內(nèi)部而形成一個(gè)高分子量的可溶球狀復(fù)合物。Mercier等[8-9]發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞后，GRA6移至納蟲(chóng)泡的后部，同GRA2一樣，定位于一簇多層小囊泡，GRA2起著誘導(dǎo)納蟲(chóng)泡表面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的作用，GRA6的作用是穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；隨后Mercier等采用基因敲除技術(shù)，分別敲除了弓形蟲(chóng)的GRA2和GRA6基因，發(fā)現(xiàn)GRA2敲除株侵入宿主細(xì)胞后其納蟲(chóng)泡不能正確形成，管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被一些小的凝集物取代，而且GRA6也不能正確的定位于管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)上，GRA6敲除株雖然能夠形成成熟的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，但由于缺乏GRA6，排列有序的管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被小的囊泡所取代。

3 GRA6在弓形蟲(chóng)基因分型方面的研究

在弓形蟲(chóng)的分子遺傳學(xué)研究中，PCR-RFLP被廣泛應(yīng)用于蟲(chóng)株基因型的研究。Fazaeli等[10]用核酸分析軟件比較，已報(bào)道9株不同弓形蟲(chóng)地理株（TONT、CASTELLS、RUB、MAS、M7741、NED、ME49、BEVERLEY和RH）的GRA6基因序列，發(fā)現(xiàn)在N端區(qū)域基因較為保守，而C端區(qū)域有一定的差異；采用序列多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)不同弓形蟲(chóng)株的GRA6基因存在著變異，通過(guò)序列比對(duì)，觀察到在GRA6基因690 bp的序列中有24個(gè)核苷酸位點(diǎn)有多態(tài)性，弱毒株還有6個(gè)氨基酸的缺失，所有位點(diǎn)多態(tài)性均可導(dǎo)致氨基酸序列的改變，氨基酸序列的變化導(dǎo)致弓形蟲(chóng)不同蟲(chóng)株的抗原性和毒力發(fā)生差異。Howe等[11]對(duì)來(lái)自人和動(dòng)物的106株弓形蟲(chóng)株DNA的6個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行PCR-RFLP分析，根據(jù)基因序列相似性將106個(gè)蟲(chóng)株分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個(gè)基因型，極少數(shù)蟲(chóng)株屬于混合型?；蛐廷竦墓蜗x(chóng)是強(qiáng)毒株，在小鼠模型中致病性很強(qiáng)，產(chǎn)生高度蟲(chóng)血癥；基因型Ⅱ與慢性感染之間具有密切關(guān)系，并使小鼠模型產(chǎn)生高負(fù)荷的包囊，人類(lèi)弓形蟲(chóng)病主要與基因型Ⅱ的弓形蟲(chóng)株有關(guān)；基因型Ⅲ的弓形蟲(chóng)在動(dòng)物體內(nèi)出現(xiàn)的頻率高于人。Fazaeli等[10]用MseⅠ酶對(duì)30株弓形蟲(chóng)的GRA6基因進(jìn)行PCR-RFLP分析，結(jié)果顯示GRA6基因可作為分子標(biāo)記用于PCRRFLP分析，以區(qū)分弓形蟲(chóng)種株間的基因型。

Zia-Ali等[12]在伊朗Tehran和Mazandaran地區(qū)，以GRA6作為分型基因，對(duì)該地區(qū)中血清學(xué)檢測(cè)為陽(yáng)性的24只綿羊，5只山羊，23只野雞，5只鴨，2只野貓，分離出弓形蟲(chóng)后進(jìn)行基因分型，結(jié)果只發(fā)現(xiàn)基因II型和III型，未發(fā)現(xiàn)基因1型或者混合感染的情況。Peyron等為了研究弓形蟲(chóng)的種類(lèi)，地域分布以及弓形蟲(chóng)病的臨床癥狀等方面的內(nèi)容，以GRA5 和GRA6為抗原用間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)來(lái)自歐洲不同國(guó)家及哥倫比亞252份慢性感染弓形蟲(chóng)的孕婦的血清進(jìn)行分型，結(jié)果顯示歐洲為II型弓形蟲(chóng)感染，哥倫比亞則為I和III型。謝德華等[13]首次對(duì)國(guó)內(nèi)來(lái)自不同宿主的4個(gè)弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株以及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株RH 株的GRA6 基因進(jìn)行PCR-RFLP 分析，發(fā)現(xiàn)RH株、SH株、CN 3 株弓形蟲(chóng)的GRA6基因序列的MseΙ酶切位點(diǎn)與國(guó)外報(bào)道的RH 株一致，同屬于基因型Ι為強(qiáng)毒株；QH株 和ZS 2株弓形蟲(chóng)的MseΙ酶切位點(diǎn)與國(guó)外報(bào)道的弱毒株BEVERLEY 株和ME49 株一致，同屬于基因型Ⅱ。除MseΙ酶切位點(diǎn)外，中國(guó)的幾個(gè)蟲(chóng)株GRA6 序列與GenBank中注冊(cè)的RH株及BEVERLEY 和ME49 兩株弱毒株有個(gè)別堿基的差異，這些差異可能是由于蟲(chóng)株的地域差異造成的。

4 GRA6在弓形蟲(chóng)病診斷和疫苗研制方面的研究

常用的弓形蟲(chóng)診斷試劑盒以速殖子作為診斷抗原，而速殖子一般經(jīng)鼠腹水或組織培養(yǎng)中進(jìn)行繁殖而獲得，故帶有各種不同的蟲(chóng)體外物質(zhì)。由于缺少純化的標(biāo)準(zhǔn)抗原或標(biāo)準(zhǔn)的純化抗原的方法，各種實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有所不同[14]。目前對(duì)弓形蟲(chóng)診斷的進(jìn)展主要是通過(guò)抗原基因克隆與表達(dá)手段，用純化的重組蛋白作為診斷抗原，檢測(cè)感染者血清抗體。GRA6分子存在于弓形蟲(chóng)的致密顆粒及納蟲(chóng)泡中并能分泌出來(lái)，當(dāng)速殖子分裂并侵入細(xì)胞時(shí)，它便可作為抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因而抗GRA6抗體可以作為早期活動(dòng)性感染的指標(biāo)。

Lecordie等分別從弓形蟲(chóng)GRA6基因偏N端和偏C端區(qū)域擴(kuò)增基因片段，導(dǎo)入表達(dá)質(zhì)粒pGEX，然后在大腸埃希菌中進(jìn)行表達(dá)，得到位于偏N端親水區(qū)域蛋白和位于偏C端親水區(qū)域蛋白，而只有編碼偏N端重組抗原能被弓形蟲(chóng)感染者血清所識(shí)別，用GRA6偏N端親水蛋白多肽構(gòu)建重組蛋白檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染者血清IgG 的敏感性達(dá)96%。李越希等[15]分別選擇弓形蟲(chóng)GRA6 蛋白和P30 蛋白內(nèi)的抗原性強(qiáng)、特異性好的部分片段，利用基因工程技術(shù)表達(dá)兩者的融合蛋白，用該融合蛋白作為抗原，間接ELISA試驗(yàn)檢測(cè)已知6份抗弓形蟲(chóng)陰性血清和6份抗弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清。結(jié)果顯示，6份抗弓形蟲(chóng)IgM 陰性血清均不顯色，6份抗弓形蟲(chóng)IgM陽(yáng)性血清均出現(xiàn)顯色反應(yīng)，說(shuō)明該融合蛋白有較好的抗原性和特異性。另外檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)室保存的184份正常人血清，它們的A450值均小于0.05，進(jìn)一步證實(shí)了該融合蛋白有較好的特異性。Fatoohi等用融合蛋白的方法，分別將GRA1 和GRA6 與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）連接表達(dá)在大腸桿菌，ELISA 方法分別檢測(cè)GST-GRA1 及GST-GRA6 被病人血清的識(shí)別率，發(fā)現(xiàn)GST-GRA1與GST-GRA6 可相互補(bǔ)充，使敏感性達(dá)到98 %。

Hofgartner等[16]為了準(zhǔn)確診斷孕婦弓形蟲(chóng)病的感染情況，用GRA6的重組蛋白分別進(jìn)行IgG和IgM間接ELISA試驗(yàn)，被檢孕婦按發(fā)病癥狀分為三組：急性癥狀（I組），慢性癥狀（II組）和無(wú)癥狀（III組）。為了區(qū)分I組和II組，用GRA6-IgG-ELISA檢測(cè)其敏感性分別為87.5% 和 94.1%，而用GRA6-IgM-ELISA檢測(cè)，則敏感性分別為91.7%和2.9%，說(shuō)明用GRA6的重組蛋白分別進(jìn)行IgG和IgM間接ELISA試驗(yàn)，可以從血清學(xué)上區(qū)分孕婦弓形蟲(chóng)病的急性感染和慢性感染。Gatkowska等用六種弓形蟲(chóng)重組抗原GRA6，GRA1，GRA7，p35，SAG1，SAG2來(lái)檢測(cè)小鼠感染弓形蟲(chóng)的情況。由小鼠感染不同蟲(chóng)株所制備的血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，急性感染的血清與GRA6，GRA7，p35有很高的反應(yīng)性；而慢性感染的血清則與SAG1，SAG2反應(yīng)強(qiáng)烈。這說(shuō)明用不同的重組抗原可以在臨床上鑒定弓形蟲(chóng)病的急性感染和慢性感染，GRA6作為一個(gè)理想的重組診斷抗原可以檢測(cè)弓形蟲(chóng)病急性感染的情況。Redlich等用重組的GRA6-GST融合蛋白作為檢測(cè)抗原，檢測(cè)了431份來(lái)自急、慢性弓形蟲(chóng)感染病人的血清樣本，其中對(duì)急性弓形蟲(chóng)病檢測(cè)的特異性達(dá)到99.6%，對(duì)隨機(jī)抽取的159份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率僅為4.0%。

朱翔等[17]分別從弓形蟲(chóng)昆山分離株和RH株總DNA中擴(kuò)增到編碼GRA6偏N端的基因片段，經(jīng)分析基因序列基本一致，故其重組蛋白可用于對(duì)不同地理株弓形蟲(chóng)感染的診斷；再將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-GRA6轉(zhuǎn)化大腸埃希菌中表達(dá)，免疫印跡分析證實(shí)該重組蛋白能被抗弓形蟲(chóng)血清特異IgM和IgG抗體識(shí)別，而純化的GST蛋白未能被血清識(shí)別，其結(jié)果與Makioka等[20]報(bào)道的一致，顯示了GST-GRA6重組蛋白的良好免疫反應(yīng)性，可以被急性和慢性期弓形蟲(chóng)感染者血清中IgM和IgG抗體所識(shí)別。

GRA存在于弓形蟲(chóng)速殖子階段和緩殖子階段，可作為急性感染和慢性感染的診斷抗原及可能的疫苗成分。盡管有一些報(bào)道了弓形蟲(chóng)其他蛋白抗體的保護(hù)效果，但是關(guān)于GRA6抗體的保護(hù)作用報(bào)道的很少。因此Cha等進(jìn)行了一系列試驗(yàn)用來(lái)評(píng)估致密顆粒蛋白（GRA2，GRA6）和表膜蛋白1（SAG1）的單克隆抗體在弓形蟲(chóng)速殖子入侵上的抑制效果；用以上單克隆抗體被動(dòng)免疫小鼠，然后再用致死劑量的速殖子攻擊小鼠，其存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)；用GRA6和SAG1的單克隆抗體預(yù)先處理的速殖子攻擊小鼠，其存活時(shí)間也明顯延長(zhǎng)；而用兩種單克隆抗體同時(shí)處理過(guò)的速殖子攻擊小鼠其存活時(shí)間則比任何一種都要長(zhǎng)。用GRA6單克隆抗體處理過(guò)的成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)速殖子的入侵起到很強(qiáng)的抑制作用。以上試驗(yàn)說(shuō)明GRA6的抗體對(duì)控制弓形蟲(chóng)感染起到一定作用。

5 展望

GRA6序列的多態(tài)性，特別是其序列上含有的MseΙ酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR-RFLP技術(shù)，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株分類(lèi)的首選基因之一；利用GRA6在納蟲(chóng)泡中特殊的作用機(jī)理，GRA6蛋白自身良好的反應(yīng)性，GRA6蛋白在臨床檢測(cè)弓形蟲(chóng)病感染以及感染的病程上，也已被愈來(lái)愈多地應(yīng)用。然而，GRA6蛋白作為保護(hù)性抗原方面的研究卻很少，在國(guó)內(nèi)尚未有這方面的報(bào)道。是否將其研制為集基因分型、診斷、免疫為一體的多功能基因還有待于進(jìn)一步研究。如果可行，這將為弓形蟲(chóng)病的綜合預(yù)防，診斷試劑的研制起到很大的促進(jìn)作用。

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Research progress on dense granule protein 6 of Toxoplasma gondii

Wang Xuejian
（Xigu Center for Animal Disease Control and Provention，Gansu，Lanzhou 730000）

Dense granules are a series of immunologically competent proteins secreted by dense granule organelle of Toxoplasma gondii，and play important roles in the invasion，survival and propagation of Toxoplasma gondii. This paper reviews the progress in research of dense granule protein 6 including molecular structure，the function to invade，genotyping，diagnosis and vaccine development for toxoplasmosis.

Toxoplasma gondii；Dense granule protein 6；Invadsion；Diagnosis；Vaccine development

S 852.723

：A

：1005-944X（2014）02-0045-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31001061）。