許小標(biāo) 解士海 楊觀招

（廣東省惠州市皮膚病醫(yī)院，廣東 惠州516001）

研究表皮黑素細胞與毛囊角質(zhì)形成細胞在接觸性共培養(yǎng)體系中的相互作用

許小標(biāo) 解士海 楊觀招

（廣東省惠州市皮膚病醫(yī)院，廣東 惠州516001）

目的研究分析表皮黑素細胞和毛囊角質(zhì)形成細胞在接觸性共培養(yǎng)體系的建立，以及相互作用。方法用胰酶融化游離毛囊與包皮的表皮，獲得純度角度高的角質(zhì)形成細胞與黑素細胞，第三代毛囊角質(zhì)形成細胞在6孔板中接種，2 d以后按照表皮黑素細胞與毛囊角質(zhì)形成細胞之間的比例，按照1∶2、1∶10、1∶20的比例接種黑素細胞，其中在1∶10的比例中，加入-黑素細胞刺激素，在干預(yù)6 d以后，用NKI/beteb作一抗。結(jié)果以1∶10的接種比例，很符合表皮基底層的黑素細胞與角質(zhì)形成細胞比例；但是在1∶2情況下可獲得數(shù)量多的表皮黑素細胞。而在1∶20情況下可以發(fā)現(xiàn)角質(zhì)細胞、黑素細胞之間的聯(lián)系。結(jié)論表皮黑素細胞與毛囊角質(zhì)形成細胞在接觸性共培養(yǎng)體系下，非常適合用于人色素系統(tǒng)方面的研究。

表皮黑素細胞；毛囊角質(zhì)；細胞；黑素細胞

表皮黑素細胞在人體內(nèi)的生長常常需要和角質(zhì)形成細胞合并在一起，共同調(diào)節(jié)生理性質(zhì)的黑素細胞和角質(zhì)形成細胞在培養(yǎng)體系中的比例[1]。用毛囊角質(zhì)形成細胞研究，能夠充分利用增殖能力較強的毛囊角質(zhì)形成細胞和表皮黑素細胞一起培養(yǎng)，觀察不同比例條件下良種細胞生長情況以色素調(diào)節(jié)劑對黑素細胞的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

頭皮與包皮來自整形外科，在包皮環(huán)切術(shù)中取得。試劑采用華美生物工程公司制造的SP免疫組化檢測試劑盒，人黑素細胞培養(yǎng)基，人表皮細胞培養(yǎng)基、質(zhì)形成細胞、以及黑素細胞生長添加成分都來自Cascade生物公司。

1.2 方法

1.2.1 表皮黑素細胞的培養(yǎng)

將包皮標(biāo)本放入水中浸泡、沖洗，然后剪掉皮下組織，切成大約（5×3）mm的細條，在分離酶Ⅱ中溫度為37 ℃情況下消化2 h左右，分離獲得表皮，在胰酶37 ℃條件下消化10 min，過了200 d以后進行篩網(wǎng)過濾，得到單細胞懸液，以完全黑素細胞培養(yǎng)基添加生長大約是5 mL，其主要成分為：氫化可松、胎牛血清等[2]，調(diào)整細胞按照6× 105/mL的標(biāo)準(zhǔn)接種，隔2 h以后換液，等到8 d以后黑素細胞形成網(wǎng)狀，用胰酶處理，先消化下黑素細胞懸液，殘留的貼壁牢固的表皮角質(zhì)組成細胞，選擇純凈表皮黑素細胞，進行培養(yǎng)，第三代細胞作為備用。

1.2.2 毛囊角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)

選用帶毛囊的頭皮，用碘伏浸泡，用生理鹽水沖洗約10 min，清理掉表皮與真皮，把含有毛囊的真皮放在含青霉素400 U/mL與鏈霉素的培養(yǎng)基中進行漂洗大約10 min，在放進2.4 U/mL的分離酶Ⅱ中，溫度設(shè)定為37 ℃，進行消化4 h左右，然后觀察頭皮松散程度，待完全松散后，用醫(yī)學(xué)常用鑷子拔出頭皮中的毛囊，用濃度為5%的胰酶消化毛囊為5～10 min，經(jīng)過銅網(wǎng)把毛發(fā)的殘渣過濾掉，提取出純粹的單細胞液體，再使用完全的表皮細胞培養(yǎng)出添加的角質(zhì)，其成分主要為牛胰島素5 μg/mL、牛轉(zhuǎn)移因子5 μg/mL等，在10 d過后，按照80%的比例融合，含有少量黑素細胞。用胰酶處理，消化掉殘留的角質(zhì)細胞。

1.2.3 接觸性共培養(yǎng)

把第3代皮黑素細胞以2.5×104mL、2.5×103mL和5×103mL和第二代毛囊角質(zhì)形成細胞接種，在生長2 d以后的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，讓表皮黑素細胞和毛囊角質(zhì)形成細胞接種比例約為1∶2、1∶10、1∶20。采用的共培養(yǎng)基是黑素細胞培養(yǎng)基、角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基形成的混合物，隔兩天換一次液，每天認(rèn)真觀察。在共培養(yǎng)體系中選取表皮黑素細胞和毛囊角質(zhì)形成細胞比例為1∶20的一組，和不添加任何藥物的一組進行比較[3]。在培養(yǎng)黑素細胞過程中選用第三代表皮黑素細胞，在不間斷進行藥物干預(yù)，觀察黑素細胞形態(tài)的變化，當(dāng)干預(yù)6 d以后，取出蓋玻片，放入PBS內(nèi)，過了5 min后，用冷乙醇固定約10 min，進行自然干燥，用NKI/beteb稀釋一百倍當(dāng)作一抗。最后在顯微鏡下面認(rèn)真觀察后攝片。

2 結(jié) 果

表皮黑素細胞培養(yǎng)基以及添加成分比較有利于黑素細胞的貼壁、增殖，在進行換液過程中可以去掉培養(yǎng)基中很多毛囊角質(zhì)形成的細胞懸浮，基本上不會出現(xiàn)纖維細胞污染的情況。用胰酶處理第二代毛囊角質(zhì)形成細胞融合效果良好。以1∶10的接種比例，很符合表皮基底層的黑素細胞與角質(zhì)形成細胞比例；但是在1∶2情況下可獲得數(shù)量多的表皮黑素細胞。而在1∶20情況下可以發(fā)現(xiàn)角質(zhì)細胞、黑素細胞之間的聯(lián)系。

3 討 論

表皮黑素細胞和毛囊角質(zhì)形成細胞在接觸性共培養(yǎng)體系中，非常有利于發(fā)揮角質(zhì)形成細胞對黑素細胞的控制作用，且建立生態(tài)體系下的共培養(yǎng)體系，對色素性疾病發(fā)病機制研究非常重要。在本次研究中我們發(fā)現(xiàn)：①毛囊外根鞘內(nèi)部出現(xiàn)了大量的角質(zhì)形成細胞，并且在隆突的位置還出現(xiàn)了沒有分化的肝細胞，這些細胞增殖很快[4]。②在毛囊外部生成的黑素細胞較少，相應(yīng)的污染率低。③采用毛囊標(biāo)本很方便，醫(yī)師很容易采集到足量的合適毛囊，進而培養(yǎng)出角質(zhì)形成細胞[5]。

在本次研究中，角質(zhì)形成細胞在定植時需要的時間比黑素細胞長，呈小片狀的生長方式，在2 d以后再次接種黑素細胞，非常有助于細胞生長。其中黑素細胞：角質(zhì)形成細胞為1∶20，如果要獲得大量的黑素細胞，可選用1∶2的比例，篩選色素調(diào)節(jié)劑，盡量模擬生理狀態(tài)，那么在這種情形下接種比例保持1∶10最好。在角質(zhì)形成細胞的周圍黑素細胞呈現(xiàn)樹狀突出效果更明顯，這可能是因為角質(zhì)形成細胞能夠釋放一定數(shù)量的黑素細胞刺激素，起到促進黑素生成的效果，然后在共培養(yǎng)體系中發(fā)揮了更明顯的作用。在本次研究中，清晰地看到了在公培養(yǎng)體系下黑素體的3種運轉(zhuǎn)方式，但是有個別囊袋狀頂端已經(jīng)脫離了黑素細胞，這是一種偶然的黑素細胞分裂現(xiàn)象，還是黑素體的新型運轉(zhuǎn)方式，目前尚不明確?？傊?，表皮黑素細胞與毛囊角質(zhì)形成細胞在接觸性共培養(yǎng)體系下，非常適合用于人色素系統(tǒng)方面的研究。

[1] 江蕾薇,陸洪光.人表皮黑素細胞與角質(zhì)形成細胞體外共培養(yǎng)模型的構(gòu)建[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,2(2):54-55.

[2] 邵麗芳,趙廣.黑素細胞功能相關(guān)性細胞因子的研究進展[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2011,4(5):68-69.

[3] Duval C,Smit NP,Kolb AM,et al.Keratinocytes control the pheo/eumelanin ratio in cultured normal human melanocytes[J]. Pigment Cell Res,2002,15(6):440-446.

[4] Greatens A,Hakozaki T,Koshoffer A,et al.Effective inhibition of melanosome transfer to keratinocytes by lectins and niacinamide is reversible[J].Exper Dermatol,2005,30(6):619-767.

[5] 張汝芝,朱文元,馬佳.表皮黑素細胞與毛囊角質(zhì)形成細胞性共培養(yǎng)方法的建立[J].中華皮膚科雜志,2006,39(10):596-598.

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1671-8194（2014）11-0066-02