劉琴 陳美玲 高曉艷 凌婭

HPLC法測(cè)定腎炎片中蘆丁的含量

劉琴 陳美玲 高曉艷 凌婭

目的建立腎炎片中蘆丁的含量測(cè)定方法。方法采用水浴回流提取, 高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定法, 用C18柱, 以乙腈-甲醇-0.4%醋酸溶液(16:6:78)為流動(dòng)相, 檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm。結(jié)果用50%乙醇水浴回流30 min的方法提取腎炎片中蘆丁, HPLC法測(cè)定蘆丁含量, 精密度RSD為1.1%, 重復(fù)性RSD為1.2%, 加樣回收率為99.6%。結(jié)論采用回流提取HPLC法測(cè)定腎炎片中蘆丁方法可行。

腎炎片；蘆丁；高效液相色譜法

腎炎片處方由一枝黃花、車前草、馬鞭草、白前、白茅根、葫蘆殼六種藥材組成, 具有清熱解毒、 利水消腫的功效。用于急慢性腎炎和泌尿道感染等癥?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為部頒標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第6冊(cè)WS3-B-1152-92-2005, 無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)。為更好控制產(chǎn)品質(zhì)量, 對(duì)本品中蘆丁進(jìn)行含量測(cè)定方法的研究。參考目前同類制劑測(cè)定蘆丁含量的方法［1,2］, 本文采用HPLC對(duì)腎炎片中蘆丁含量進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀(Agilent 1100), UV2401 PC型紫外-可見分光光度計(jì), C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm Agilent)。

1.2試藥 腎炎片來源于江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司, 蘆丁對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈、甲醇為色譜純, 水為自制超純水, 冰醋酸、95%乙醇、無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇為分析純。

2 方法學(xué)考察與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Phenomenex luna C18(250 mm× 4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.4%醋酸溶液(16:6:78)［3］；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；柱溫30℃。

2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品2.931 mg, 置100 ml容量瓶中, 加甲醇溶解, 并稀釋至刻度, 搖勻, 即得, 濃度為29.31 μg/ml。

2.3供試品溶液的制備［3］精密稱取3 g, 置250 ml平底燒瓶中, 精密加入50%乙醇50 ml, 水浴回流30 min提取, 放冷,再稱定重量, 用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量, 搖勻, 濾過, 取續(xù)濾液, 即得。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1準(zhǔn)確度 取已知含量的樣品(蘆丁含量：0.48 mg/g)9份,每份1.5 g, 精密稱定, 置燒瓶中, 第1～3份分別加入對(duì)照品1.15 mg, 第4～6份分別加入對(duì)照品1.44 mg, 第7～9份分別加入對(duì)照品1.73 mg, 制備供試品溶液, 依法測(cè)定, 計(jì)算蘆丁的平均回收率為99.6%, RSD為1.5%, 該方法準(zhǔn)確度良好。

3.2重復(fù)性 取樣品, 按供試品溶液制備方法制備, 平行制備6份, 測(cè)定其含量結(jié)果分別為0.168, 0.172, 0.168, 0.172, 0.168, 0.170, 計(jì)算6個(gè)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.2%,試驗(yàn)結(jié)果表明, 該方法重復(fù)性良好。

3.3精密度 取對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次, 計(jì)算其峰面積RSD為0.4%, 結(jié)果表明精密度良好。

3.4專屬性驗(yàn)證 取按處方及制備工藝制備不含一枝黃花的陰性供試品, 按供試品溶液制備方法制成陰性供試品溶液。取對(duì)照品溶液、陰性供試品溶液與供試品溶液同時(shí)測(cè)定, 結(jié)果表明, 本方法專屬性良好, 陰性無(wú)干擾。見圖1。

3.5線性關(guān)系考察 精密稱取蘆丁對(duì)照品10.15 mg, 置100 ml量瓶中, 用甲醇溶解并稀釋至刻度, 搖勻。精密吸取上述溶液1、2、5、6、7、10 ml, 分別置20 ml容量瓶中, 用甲醇稀釋至刻度, 搖勻。在已確定的色譜條件下, 分別吸取上述7份對(duì)照品溶液進(jìn)樣10 ul, 測(cè)定峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo), 蘆丁濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計(jì)算得回歸方程：Y=9.8605X-0.4489, r=1。表明蘆丁在5.075～101.5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖1。

3.6穩(wěn)定性考察 取供試品溶液, 室溫放置, 依上述方法分別在0、2、4、8、12、24 h測(cè)定6次。結(jié)果蘆丁峰面積的RSD為0.4%, 表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。見圖1。

4 討論

4.1檢測(cè)過程中通過查閱參考文獻(xiàn)及對(duì)照品溶液的全波長(zhǎng)掃描效果, 對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行選擇, 以溶劑為空白在200～400 nm范圍內(nèi)繪制吸收光譜圖。實(shí)驗(yàn)表明, 蘆丁在360 nm具最大吸收, 當(dāng)采用360 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí), 蘆丁檢測(cè)靈敏度高,雜質(zhì)峰較少, 基線較平穩(wěn), 且雜質(zhì)均不干擾測(cè)定, 故選擇360 nm為其檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.2本試驗(yàn)采用水浴回流法提取, HPLC測(cè)定腎炎片中蘆丁的含量, 方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確, 適合該制劑的含量測(cè)定。

［1］ 趙海云, 康君慧.HPLC法測(cè)定腎復(fù)康膠囊中蘆丁的含量.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2008, 31(3):59-60.

［2］ 孫秋, 高瑩瑩, 常波.痔速寧片中蘆丁的含量.中國(guó)醫(yī)藥指南, 2011, 9(34):304-305.

［3］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部).北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2010:凡例.

2014-07-30］

222047 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司

凌婭