■張 瑞 吳彩紅 凡海佳 李呂木 匡厚坤 汪雙喜 丁小玲

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥230036；2.安徽太陽禽業(yè)有限公司，安徽寧國242300）

菜籽肽是菜籽蛋白經(jīng)蛋白酶作用，得到的蛋白質(zhì)水解物，由許多分子鏈長度不等的低分子小肽混合物組成。菜籽粕是油菜籽榨油后的副產(chǎn)物，是一種廉價而蛋白質(zhì)含量高的動物飼料。大量研究證實(shí)蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)并不僅僅是分解為氨基酸后才能被吸收，體內(nèi)還存在獨(dú)立的小肽直接吸收機(jī)制，且小肽的吸收效果更好[1]。小肽還具有某些特殊的生物活性，如增強(qiáng)免疫功能[2]、抗疲勞[3]、抑制血壓升高[4]及降低膽固醇[5]等作用，而這些作用均與其抗氧化活性密切相關(guān)。研究表明雙酶水解菜籽蛋白可得三種組分，各組分均有特定的抗氧化活性[6]。酶解所得到的菜籽肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性和羥自由基清除能力,當(dāng)水解度達(dá)25%時，體外實(shí)驗(yàn)羥基自由基清除率可高達(dá)80%[7]，且枯草桿菌中性蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性大于枯草桿菌堿性蛋白酶酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性,并且其抗氧化活性隨酶水解產(chǎn)物添加量的增加而增強(qiáng)[8]。Yoshie等[9]通過測定菜籽蛋白水解產(chǎn)物對DPPH(1,1-dipheny l-2-picrylhydrazy；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基；DPPH)自由基的清除能力來研究其抗氧化活性，結(jié)果表明菜籽蛋白經(jīng)過胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后，其抗氧化能力顯著增強(qiáng)。有研究表明，利用單菌固態(tài)發(fā)酵可以生產(chǎn)出不同分子量的菜籽肽，這些小肽具有清除自由基的能力，而且，肽的分子量越小，其清除自由基的能力越強(qiáng)[10]，即抗氧化活性越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)室利用枯草芽孢桿菌和乳酸菌混菌固態(tài)發(fā)酵菜麻粕后經(jīng)測定也富含小肽，但它們是否也具有抗氧化活性及其抗氧化活性強(qiáng)弱與否不得而知，為此，本研究通過分離純化發(fā)酵菜粕小肽，研究其抗氧化能力，為揭示發(fā)酵菜粕的生物功能的物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

發(fā)酵菜籽粕：由乳酸菌與枯草芽孢桿菌按照1∶1比例混合發(fā)酵，菌種由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料科技研究所提供，接種比例6%。

試劑L-酪氨酸、藍(lán)色葡聚糖-2000、氧化型谷胱甘肽（還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽用于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制）和還原型谷胱甘肽由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；2,2-二苯基-1-苦味肼基(DPPH)由上海源葉生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；膠Sephadex G-15購自北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司。

752紫外可見分光光度計和層析柱(2.6 cm×60 cm)分別為上海浦東物理光學(xué)儀器廠和上海錦華層析設(shè)備廠產(chǎn)品；HD-21-1核酸蛋白檢測儀、DHL-A電腦恒流泵和SBS-100自動液相色譜層析儀均為上海青浦瀘西儀器廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵菜籽粕粗提液中的蛋白多肽的測定

采用福林酚法測定。按照料水比1∶6.0的比例（W:V）,先用無菌水浸泡發(fā)酵菜粕并攪拌5 min，然后過濾，濾液即為發(fā)酵菜粕蛋白多肽的粗提液。試管中加入粗提液樣品1.0 ml（空白為1.0 ml純水）,加A液（體積比A1∶A2∶A3=100∶1∶1，A1為20 g無水碳酸鈉+4 g氫氧化鈉溶于1 L水所得，A2為0.2 g五水硫酸銅溶于20 ml水所得，A3為0.4 g酒石酸溶于20 ml水所得）5ml，混勻后室溫放置10 min，再加B液（福林酚試劑）0.5 ml立即混勻，室溫放置30 min，在750 nm波長下以空白對照調(diào)零，測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測粗提液樣品的蛋白多肽濃度。

1.2.2 發(fā)酵菜籽粕中小肽的提取優(yōu)化

將樣品調(diào)成不同的料水比，通過Sephadex G-15分離純化，分析不同料水比的樣品經(jīng)Sephadex G-15層析后的洗脫曲線，得到最佳的提取效果。

1.2.3 發(fā)酵菜籽肽的分離純化

發(fā)酵菜籽肽粗提液過0.45 μm濾膜后進(jìn)行分離純化，分離純化所用采用凝膠層析柱為Sephadex G-15。上樣量為1 ml，流速是0.5 ml/min，檢測波長為280 nm，洗脫雙蒸水的pH=7.0。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

凝膠層析組分小肽分子質(zhì)量測定用藍(lán)色葡聚糖-2 000測定外體積V0，用鉻酸鉀測總體積Vt。分別用L-酪氨酸(Mw=181.19)、還原型谷胱甘肽(Mw=307.32)、氧化型谷胱甘肽(Mw=612.6)上柱，層析柱(2.6 cm×60 cm)，上樣量為1 ml，洗脫流速是 0.5 ml/min，洗脫液為雙蒸水，檢測波長是280 nm，測得標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫體積Ve。將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)(lgM)作為橫坐標(biāo)，洗脫體積（Ve）作為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用菜籽肽粗提液代替標(biāo)準(zhǔn)蛋白，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法操作，得出洗脫體積，重復(fù)測定1～2次，取洗脫體積的平均值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程算出樣品的分子質(zhì)量。

1.2.5 小肽含量及抗氧化測定

小肽的測定采用福林酚法[11]，重復(fù)測定2次。DPPH自由基清除作用的測定、·OH清除作用的測定和還原力測定參照彭惠惠等方法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 福林酚法測定多肽結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)福林酚試劑使用方法，分別測定濃度(mg/ml)為0.05、0.1、0.2、0.285 7、0.4、0.5的牛血清蛋白的OD值，得到結(jié)果分別是0.121、0.160、0.291、0.420、0.478、0.508。制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 菜籽多肽濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 發(fā)酵菜籽粕蛋白多肽粗提液OD值測定

測得料水比為1∶6.0的發(fā)酵菜籽粕蛋白多肽粗提液的OD值為0.303，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白濃度為3.191 4 mg/ml，因此該發(fā)酵菜籽粕粗提液的蛋白多肽含量為19.15%。

2.2 發(fā)酵菜籽粕中小肽的提取優(yōu)化結(jié)果

研究不同梯度料水比對菜籽肽提取的影響，發(fā)現(xiàn)不同的料水比提取效果不同，在料水比為1∶5.5時取得最佳提取效果。

2.3 發(fā)酵菜籽粕中不同小肽的分離提取

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用L-酪氨酸(Mw=181.19)、還原型谷胱甘肽(Mw=307.32)、氧化型谷胱甘肽(Mw=612.6)的洗脫體積分別為 96、124、142 ml。所作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，擬合后所得回歸方程為：y=-87.117x+339.62，其相關(guān)系數(shù)為0.997 6，可見lgM與洗脫體積具有線性相關(guān)性。

圖2 Sephadex G-15測分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 Sephadex G-15檢測菜籽肽的相對分子質(zhì)量分布

經(jīng)Sephadex G-15凝膠色譜柱分離菜籽肽粗提液后，得到2個峰（見圖3），峰1和峰2的洗脫體積分別為87 ml和145 ml。將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程，即可求得這兩個組分的分子質(zhì)量分別為794Da和171Da，即兩個組分為8肽、2肽。將收集的2個組分的洗脫液進(jìn)行冷凍存放，待進(jìn)一步分析。

圖3 菜籽肽Sephadex G-15柱層析洗脫圖譜

2.4 菜籽肽的抗氧化活性研究

2.4.1 菜籽肽對DPPH自由基清除作用(見圖4)

由圖4可知，分離得到的各菜籽8肽和菜籽2肽對DPPH自由基均具有清除能力，并且表現(xiàn)出很好的量效關(guān)系。2肽的清除率在各濃度下都高于8肽，可以得出對于濃度相同、分子量不同的小肽而言，清除DPPH自由基的能力2肽強(qiáng)于8肽。這與Chen等[13]的研究結(jié)果一致，即肽的分子量大小直接影響其抗氧化活性程度，其可能的原因是具有抗氧化活性小肽含有某些特殊的供氫基團(tuán)能與自由基反應(yīng)，而這些基團(tuán)只當(dāng)小肽分子量適當(dāng)時，才能得到最大的暴露充分并與自由基作用，進(jìn)而發(fā)揮較強(qiáng)的抗氧化作用。

圖4 菜籽肽清除DPPH自由基能力的比較

2.4.2 菜籽肽對·OH自由基清除作用(見圖5)

圖5 菜籽肽清除·OH自由基能力的比較

由圖5可見，在試驗(yàn)濃度（0.1～1 mg/ml）范圍內(nèi)菜籽肽對·OH均有清除作用，并且其抗氧化活性隨著菜籽肽濃度的增加而增強(qiáng)。由于菜籽肽中含有供氫體，能夠還原具有氧化性的自由基的質(zhì)子，從而使自由基連鎖反應(yīng)終止，實(shí)現(xiàn)抑制或清除自由基的目地。因此，隨著濃度的增加導(dǎo)致供氫體增多，使得提供質(zhì)子的能力增強(qiáng)，致使抗氧化性隨之提高。從圖5不難看出，羥基自由基的清除能力，菜籽2肽要強(qiáng)于菜籽8肽。

2.4.3 菜籽肽還原力測定(見圖6)

測定樣品的吸光度的大小可反映出還原力大小，還原力強(qiáng)則吸光度大。由圖6可見，在試驗(yàn)濃度（0.5～5 mg/ml）范圍內(nèi)，菜籽肽總還原力與濃度的關(guān)系也是線性相關(guān)關(guān)系。眾所周知，抗氧化劑是通過還原作用給出電子來清除自由基的[14]，抗氧化性越強(qiáng)，其還原力也越強(qiáng)。本試驗(yàn)中隨著肽濃度的增加，肽的抗氧化性也隨之增強(qiáng)，且2肽的還原力比8肽強(qiáng)，這一結(jié)果與清除DPPH、·OH自由基活性一致。用還原型谷胱甘肽作為對照，3 mg/ml 2肽、5 mg/ml 8肽和0.5 mg/ml谷胱甘肽的OD值相同，說明這些物質(zhì)的總還原力是相當(dāng)?shù)摹?/p>

圖6 菜籽肽總還原力的比較

3 結(jié)論

菜籽粕經(jīng)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的2肽與8肽均具有抗氧化性，其抗氧化性與菜籽肽的濃度呈正相關(guān)，并且2肽的抗氧化能力比8肽強(qiáng)。