陳曉明，湯碧娥，孫瑋明，汪 洋△

急性心肌梗死死亡率高，目前臨床常用溶栓療法和經(jīng)皮穿刺腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)治療急性心肌梗死，一方面挽救了大量瀕臨死亡的心肌，但又引起了不容忽視的心肌缺血／再灌注損傷（ischemia／reperfusion，I／R）。研究發(fā)現(xiàn)，I／R損傷過程中心肌細胞發(fā)生嚴(yán)重的Ca2＋平衡紊亂，而細胞內(nèi)Ca2＋超載導(dǎo)致的一系列鈣依賴性酶的激活可能是引起心肌損傷的主要原因［1］。Calpain是一類Ca2＋激活的中性蛋白酶，參與細胞骨架調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細胞凋亡等生理和病理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，心肌I／R時，這種鈣依賴性的蛋白酶的激活，是導(dǎo)致心肌死亡、功能受損的主要原因［2］。

高鐵血紅素在心血管系統(tǒng)中表現(xiàn)出強大的細胞保護作用。高鐵血紅素可減輕兔體外循環(huán)后心肌I／R損傷［3］；降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管功能障礙［4］。雖然已證實高鐵血紅素具有心肌保護作用，但其作用機制是否通過影響再灌注心肌calpain的活化還不明了。故本實驗旨在大鼠急性I／R模型上，觀察高鐵血紅素在calpain對心肌I／R損傷中的作用，并初步探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物和藥品

SD大鼠，雄性，體重230～250 g，購自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。高鐵血紅素、鋅原卟啉IX、calpain抑制劑MDL28170、氯化三苯基四氯唑購自美國Sigma公司。Calpain和caspase3活性檢測試劑盒購自Promega公司。Calpastatin抗體購自Santa Cruz公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。改良 Krebs-Henseleit（K-H）成分如下（mmol／L）：NaCl 118，NaHCO325，K2PO41.2，KCl 4.7，MgSO41.2，，CaCl21.25，葡萄糖 10.0，pH 7.4。

1.2 實驗分組

64只雄性SD大鼠隨機8組（n＝8）。假手術(shù)組（sham）：取離體心臟灌流，冠脈左前降支下穿線不結(jié)扎。I／R組：離體心臟缺血 40 min，再灌注 30 min。MDL28170＋I／R組（MDL＋I／R）：離體心臟于再灌注0～5 min給予 calpain的抑制劑 MDL28170（10μmol／L），其余與 I／R組相同。單純 MDL28170組（MDL）：取離體心臟灌流，冠脈左前降支下穿線不結(jié)扎，30 min后給予 MDL28170（10μmol／L）灌流 5 min。高鐵血紅素 ＋I／R組（hemin＋I／R）：離體心臟 I／R前 24 h，大鼠腹腔注射50 mg／kg高鐵血紅素。單純高鐵血紅素組（hemin）：大鼠腹腔注射50 mg／kg高鐵血紅素，24 h后取離體心臟灌流，冠脈左前降支下穿線不結(jié)扎。鋅原卟啉IX＋高鐵血紅素＋I／R組（ZnPP＋hemin＋I／R）：離體心臟 I／R前 24 h，大鼠先腹腔注射 25μg／kg鋅原卟啉 IX，20 min后再注射 50 mg／kg高鐵血紅素。單純鋅原卟啉IX組（ZnPP）：大鼠腹腔注射25μg／kg鋅原卟啉 IX，24 h后取離體心臟灌流，冠脈左前降支下穿線不結(jié)扎。前4組大鼠在實驗前腹腔注射生理鹽水。

1.3 離體心臟I／R模型

雄性SD大鼠用戊巴比妥鈉（60 mg／kg）腹腔麻醉后，開胸并迅速取出心臟，用預(yù)冷的改良K-H液洗去血液后，采用Langendorff灌流法，用改良K-H液灌流，灌流液事先用95%O2＋5%CO2飽和，灌注壓為76 mmHg，溫度37℃。從心耳向左心室內(nèi)插入水囊，用生物信號采集系統(tǒng)檢測心室內(nèi)壓的變化，記錄左室發(fā)展壓 （left ventricular developed pressure，LVDP）。采用結(jié)扎冠脈的左前降支40 min作為缺血，以松開結(jié)扣30 min作為再灌注。

1.4 心臟梗死面積測定

實驗結(jié)束后，在左前降支原結(jié)扎處重新結(jié)扎，將1%伊文斯藍注射入主動脈。然后將左心室縱向平均切成6片，用1%氯化三苯基四氯唑孵育15 min后，切片掃描。計算心肌梗死面積（%）＝灰白色的梗死區(qū)面積÷（紅色的非梗死區(qū)面積＋灰白色的梗死區(qū)面積）×100%

1.5 乳酸脫氫酶測定

再灌注30 min后立即收集冠脈流出液，用全自動生化分析儀測定冠脈流出液中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活性。

1.6 血紅素氧化酶（heme oxygenase，HO）活性測定

取左心室心尖部，制成10%勻漿液。取20μl心肌勻漿液、加入等體積的肝組織勻漿液，2倍體積的2 mmol／L高鐵血紅素和 4.5 mmol／L還原型輔酶Ⅱ（NADPH），混勻后再加入1.8 ml含鎂的磷酸鹽緩沖液，于37℃避光反應(yīng)10 min。用雙波長法于464 nm和 530 nm處測定膽紅素生成量（pmol／mg·h）。

1.7 Calpain和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase 3）活性檢測

Calpain和caspase 3活性檢測參照Promega操作手冊，用多功能熒光分析儀Wallac 1420 Explorer檢測。測得的相對光單位反映calpain和caspase3的活性。

1.8 Western blot檢測calpain蛋白表達

取左心室心尖部加入組織裂解液裂解，離心取蛋白沉淀。Lowry法測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后，蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜2 h，洗膜后加入Calpastatin一抗，4℃反應(yīng)過夜，次日洗膜，隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫反應(yīng)1 h。洗膜，加入ECL顯色劑，X片顯影。以β-actin為內(nèi)參。用Quality One圖象分析軟件，根據(jù)光密度定量分析。

1.9 統(tǒng)計處理

各組資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，用Prism 5.0軟件采用 one-way ANOVA以及 Newman-Keuls post hoc test做統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 Calpain在I／R心肌損傷中的作用

與假手術(shù)組比，心肌 I／R后 calpain、caspase 3活性明顯增高（P＜0.01，表1）。心肌I／R后LDH釋放量增加，LVDP明顯下降，心肌梗死面積增大（P＜0.01，表 2）；而在缺血前和再灌注期給予 calpain的抑制劑MDL28170，可對抗I／R大鼠LDH釋放量和Caspase 3活性的增加，LVDP的下降，心肌梗死面積的增大（P＜0.01，表 1、表 2）。與假手術(shù)組相比，單純MDL28170組各指標(biāo)無明顯變化。

2.2 高鐵血紅素對I／R心臟各指標(biāo)的影響

大鼠預(yù)先給予高鐵血紅素后，心臟HO-1活性增加（P＜0.01，表 1）。與 I／R組比，高鐵血紅素 ＋I／R組 calpain和 caspase 3活性下降（P＜0.01，表1）；LDH釋放量減少，LVDP明顯增高，心肌梗死面積縮?。≒＜0.01，表 2）。與假手術(shù)組相比，單純用高鐵血紅素組對正常心肌無明顯損傷作用。

Tab.1 Changes of calpain，caspase 3 and heme oxygenase（HO）activities in different groups（ˉx±s，n＝8）

Tab.2 Changes of LDH，left ventricular developed pressure（LVDP），and infarct size in different groups（ˉx±s，n＝8）

2.3 鋅原卟啉IX對高鐵血紅素保護作用的影響

實驗前24 h給予HO-1的抑制劑鋅原卟啉IX后，能對抗高鐵血紅素的保護作用，表現(xiàn)在，與高鐵血紅素＋I／R組相比，高鐵血紅素＋鋅原卟啉IX＋I／R組calpain和caspase 3活性增高，LDH釋放量明顯增加，LVDP明顯下降，心肌梗死面積增大（P＜0.01，表 1、表 2）。與假手術(shù)組相比，單純鐵原卟組對正常心肌無明顯損傷作用。

2.4 Calpastatin在高鐵血紅素心肌保護作用中的地位

心肌I／R后，心肌calpastatin表達量明顯低于對照組，高鐵血紅素＋I／R組與單純 I／R組相比，Calpastatin表達量增高，而HO-1的抑制劑鋅原卟啉IX可取消此作用（P＜0.05，表 3）。

3 討論

Calpain是一種鈣激活的中性半胱氨酸蛋白酶，生理條件下以非活性形式存在于胞漿中。心肌I／R時，胞內(nèi)游離Ca2＋濃度增加，calpain由胞漿轉(zhuǎn)位至細胞膜并被激活?；罨腸alpain在細胞凋亡中具有重要的作用［5］：calpain激活后可裂解 Bax產(chǎn)生18 kD的高效促凋亡的片段（Bax／p18），后者轉(zhuǎn)位到線粒體，導(dǎo)致線粒體滲透性改變、細胞色素 C釋放和caspase級聯(lián)激活；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的細胞凋亡途徑中，calpain激活還可導(dǎo)致caspase-12活性增加，繼而活化 caspase-9、3或者裂解抑凋亡Bcl-xl分子的“l(fā)oop”環(huán)使之成為促凋亡蛋白導(dǎo)致細胞凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌I／R后，calpain活性增加，而再灌注早期給予calpain抑制劑確實可以減少細胞凋亡的發(fā)生，縮小心肌梗死面積，促進心功能的恢復(fù)。

Tab.3 Expression of calpastatin protein in different groups（ˉx±s，n＝3）

HO在哺乳動物體內(nèi)有2種亞型，其中HO-2是原生型的酶，而HO-1主要由誘導(dǎo)產(chǎn)生。誘導(dǎo)HO-1活性增加，被認為具有強大的對抗氧化應(yīng)激的作用，在不同的組織器官中均表現(xiàn)出強大的細胞保護作用［6］。近年來的研究表明，HO-1的抗細胞損傷作用與calpain活性的抑制有一定的關(guān)系。如Chen等人在人臍靜脈內(nèi)皮細胞高糖模型上的證實，高糖環(huán)境可誘導(dǎo)細胞發(fā)生calpain依賴性凋亡，而葛根素可通過誘導(dǎo)HO-1表達，抑制高糖誘導(dǎo)的calpain激活，減少細胞凋亡的發(fā)生［7］。鈣蛋白酶抑素calpastatin是目前最為明確的一種內(nèi)源性calpain抑制蛋白。糖尿病小鼠模型上的研究也表明，calpastatin過表達可通過抑制calpain激活，減輕糖尿病小鼠心肌I／R損傷，促進再灌注期心功能的恢復(fù)［8］。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌I／R后calpastatin表達明顯下降。此現(xiàn)象與早期Pedrozo等人在新生乳鼠心肌細胞缺氧再復(fù)氧模型上的報道一致［9］。高鐵血紅素預(yù)處理后I／R心肌calpastatin表達增加，calpain活性明顯受抑制，而HO-1抑制劑可取消此作用。提示，高鐵血紅素可能通過抑制I／R心肌calpastatin表達的下降，減少calpain的激活，從而對抗心肌損傷。

綜上所述，高鐵血紅素預(yù)處理可減輕大鼠心肌I／R損傷，其機制可能與誘導(dǎo) HO-1，增加 calpastatin蛋白表達，抑制calpain的激活有關(guān)。

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