劉亞坤，黃林靜，趙 珊，林 偉，何金波，應(yīng) 磊，游 昕，王萬鐵△

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)缺血/再灌注損傷研究所，浙江 溫州 325035;2.解放軍第四五四醫(yī)院胸心外科，江蘇 南京 210002)

全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是由炎癥介質(zhì)激活中性粒細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞等釋放多種毒性物質(zhì)造成組織損傷而導(dǎo)致的全身性炎癥反應(yīng)。中西醫(yī)結(jié)合是現(xiàn)代治療SIRS的重要措施，血必凈注射液(Xuebijing injection，XBJI)，其成分為紅花 、赤芍 、川芎、丹參 、當(dāng)歸等中藥材提取物的有效成份組成，生藥濃度為0.5g/ml，單味中藥的濃度為0.1 g/ml，其提取物的有效成分包括紅花黃色素A濃度＞0.5 mg/ml，芍藥苷濃度＞1 mg/ml，阿魏酸濃度＞0.01 mg/ml。主要成分為紅花黃色素A，具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)、潰散毒邪的作用，可以拮抗內(nèi)毒素并抑制內(nèi)源性炎性介質(zhì)失控釋放。臨床研究證明[1]，XBJI能改善多種原因?qū)е碌腟IRS癥狀，能有效調(diào)控炎性反應(yīng)過程。然而，有關(guān)XBJI改善SIRS的機(jī)制尚未明確，并且XBJI在心臟疾病方面的研究相對較少，我們的實驗在臨床療效的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究XBJI對缺氧/復(fù)氧大鼠心肌炎性反應(yīng)的抑制作用，并探討其機(jī)制。

本實驗利用易于控制的langendorff離體心臟灌流裝置，進(jìn)行了大鼠離體心臟灌流實驗，用以模擬臨床的體外循環(huán)。通過觀察XBJI對缺氧/復(fù)氧大鼠心肌白介素 1β(interleukin-1β，IL-1β)、核因子-κ Вp65(nuclear factor kappa B p65 ，NF-κ Вp65)、Toll樣受體 4(toll like receptor 4，TLR4)表達(dá)的影響，探討 XBJI抑制炎性反應(yīng)的可能機(jī)制，從而為臨床應(yīng)用XBJI防治心肌缺血/再灌注損傷提供更多的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠，體重(280±30)g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[動物使用許可證號為SYXK(浙)2010-0150]。

1.2 主要試劑

血必凈注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司，批號:Z20040033);大鼠白介素-1β(IL-1β)ELISA 試劑盒(上海西唐生物科技有限公司);DNA Ladder(上海捷瑞公司)，RT-PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，RT-PCR試劑盒(美國Fermentas公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，瓊脂糖(德國Biowest公司);X線膠片(柯達(dá)公司)，顯影定影試劑盒(南京凱基生物公司)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Millipore公司)，彩色預(yù)染蛋白Marker(美國Fermentas公司)，封閉用奶粉(美國BD公司)，PVDF膜(美國Millipore公司)，BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，小鼠抗鼠 TLR4單克隆抗體(sc-293072，Santa Cruz)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(碧云天生物技術(shù)研究所)，兔抗鼠NF-κ Вp65 多克隆抗體(ab7970，abcam)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(ab6721，abcam)，兔抗鼠GAPDH多克隆抗體(中國杭州賢至生物科技有限公司)，其余為市售分析純。

1.3 實驗分組

SD大鼠36只隨機(jī)分為6組(n=6):正常組(N組)、平衡灌注組(BP組)、模型組(M 組)、小劑量XBJI組(XBJIL組，按照每100ml改良ThomasⅡ停搏液中加入2 ml XBJI配置而成，2 ml/100ml)、中劑量XBJI組(XBJIM組，按照每100ml改良ThomasⅡ停搏液中加入4 ml XBJI配置而成，4 ml/100ml)、大劑量XBJI組(XBJIH組，按照每100ml改良ThomasⅡ停搏液中加入8 ml XBJI配置而成，8 ml/100ml)。

1.4 模型建立

將心臟懸掛在langendorff離體心臟灌流裝置(ML870B2，ADInstruments，Australia)，經(jīng)主動脈進(jìn)行逆行灌注[2]，采用恒溫恒壓灌流，灌注液溫度為(37±0.5)℃。K-H緩沖液成分(g/L):NaCl 6.9251、KCl 0.3578 、CaCl20.2775、NaHCO32.1003、KH2PO40.1633、MgSO4?7H2O 0.2958、Glucose 2.1997。灌注壓 100mmHg，灌注液通有95%O2+5%CO2混合氣體，并且預(yù)充30min，pH(7.40±0.05)。N組開胸取出心臟后，直接保存心肌組織以備后續(xù)指標(biāo)檢測;BP組在建立langendorff離體心臟灌注模型的基礎(chǔ)上，平衡灌注20min后，將心臟保存;M組在建立langendorff離體心臟灌注模型的基礎(chǔ)上，平衡灌注20min后，持續(xù)灌注改良ThomasⅡ停搏液3 min，使心臟完全停搏。改良ThomasⅡ停搏液成分(g/L):NaCl 6.4284、KCl 1.1928 、CaCl20.1332 、NaHCO30.08401 、MgCl2?6H2O 3.2528。繼而停灌30min，然后再復(fù)灌K-H緩沖液使其復(fù)跳并持續(xù)灌注120min;XBJIL組、XBJIM組、XBJIH組分別在改良ThomasⅡ停搏液中按比例加入XBJI 2 ml/100ml、4 ml/100ml、8 ml/100ml，其他處理與M組相同。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 ELISA方法檢測心肌組織中IL-1β的濃度取低溫保存的心肌組織100mg置于研缽中，加液氮研成粉末后，加入1 ml生理鹽水，充分勻漿，取上清液，BCA 法進(jìn)行蛋白定量，大鼠白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒進(jìn)行IL-1β濃度檢測。酶標(biāo)儀測出OD值，然后計算出總蛋白濃度、IL-1β濃度，以IL-1β濃度與總蛋白濃度比值表示IL-1β的相對濃度。

1.5.2 Western blot 檢測心肌組織中 NF-κ Вp65 及TLR4蛋白的表達(dá) 參考文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行心肌組織蛋白的提取。配置10%SDS-PAGE分離膠和3%濃縮膠，每孔加入20μg蛋白樣品，置入電泳緩沖液中，90V電泳約20min，120V電泳約60min。采用濕式電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%脫脂奶粉于室溫下封閉90min，分別加入Ⅰ抗NF-κ Вp65抗體(1∶1000)、TLR4 抗體(1∶1000)及GAPDH 抗體(1∶1000)。4℃反鋪法孵育過夜。再加入相應(yīng)的Ⅱ抗，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯色，X射線底片曝光。結(jié)果用Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行分析。

1.5.3 RT-PCR方法檢測心肌組織中NF-κ Вp65及TLR4 mRNA的表達(dá) Trizol法抽提總 RNA，取總RNA 1μl用蛋白核酸儀(美國 Thermo公司)進(jìn)行RNA濃度的檢測，記錄RNA濃度及A260/A280比值判斷純度(A260/A280值在1.8～2.0之間視為純度較高，否則，重新提取 RNA)，將各組RNA濃度用DEPC水調(diào)至2 ug/ul。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，再按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行 cDNA 擴(kuò)增。NF-κ Вp65 上游引物:5′-GATAAAAT CCTCGGGGTCCTAC-3′，下游引物 :5′-GCTGCTATGTGTAGAGGTGTCG-3′，擴(kuò)增片段長度:299 bp。β-actin 內(nèi)參上游引物 :5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游引物:5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′，擴(kuò)增片段長度:432 bp。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性 30s，59.3℃退火 30s，72℃延伸1 min，72℃后延伸 5 min，循環(huán)次數(shù)27次。TLR4上游引物 :5′-CATCCAAAGGAATACTGCAACA-3′，下游引物:5′-GTTTCTCACCCAGTCCTCATTC-3′，擴(kuò)增片段長度:398 bp。GAPDH 內(nèi)參上游引物:5′-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3′，下游引物:5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，擴(kuò)增片段長度 :595 bp。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1 min，72℃后延伸5 min，循環(huán)次數(shù)28次。PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙啶染色后，用凝膠成像儀記錄。用Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)分析灰度值。

1.5.4 組織學(xué)觀察心肌結(jié)構(gòu)的變化 各組最后停灌后，迅速從心尖部同一部位取材，用10%的甲醛溶液(福爾馬林)固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)、心肌細(xì)胞的改變及炎性細(xì)胞的浸潤情況，并拍片。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織中IL-1β濃度的變化

XBJI可降低缺氧/復(fù)氧心肌中IL-1β的濃度，以XBJIM為佳(表1)。

2.2 各組大鼠心肌組織 NF-κ Вp65及 TLR4蛋白的變化

XBJI可降低缺氧/復(fù)氧心肌NF-κ Вp65及 TLR4蛋白的表達(dá)，以XBJIM最佳(表2，圖1)。

Tab.1 Change of IL-1β concentration inmyocardial tissue of each group(，n=6)

Tab.1 Change of IL-1β concentration inmyocardial tissue of each group(，n=6)

N:Normal group;BP:Balanced perfusion group;M:Model group;XBJIL:Low dose XBJI group;XBJIM:Middle dose XBJI group;XBJIH:High dose XBJI group;XBJI:Xuebijing injection*P＜0.05 vs N group;#P＜0.05 vs BP group;△△P＜0.01 vs M group;▲P＜0.05 vs XBJILgroup;○P＜0.05 vs XBJIMgroup

Group IL-1β 9.5517±2.1026*#XBJIL 5.5499±0.7935△△XBJIM 5.3018±0.5051△△XBJIH 7.9382±1.8726▲○6.9601±2.7438 BP 6.7603±2.3801 M N

Tab.2 Expression of NF-κ В p65 protein ，and TLR4 protein in myocardial tissue of each group(，n=6)

Tab.2 Expression of NF-κ В p65 protein ，and TLR4 protein in myocardial tissue of each group(，n=6)

N:Normal group;BP:Balanced perfusion group;M:Model group;XBJIL:Low dose XBJI group;XBJIM:Middle dose XBJI group;XBJIH:High dose XBJI group;XBJI:Xuebijing injection*P＜0.05，**P＜0.01 vs N group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs BP group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs M group;▲P＜0.05 vs XBJILgroup

Group NF-κ Вp65 TLR40.0931±0.0436 0.1756±0.0606 BP 0.1631±0.0455 0.2747±0.0535**M 0.4007±0.1487**##0.4273±0.1023**##XBJIL 0.2623±0.0814**#△△ 0.3469±0.0675**△XBJIM 0.1691±0.0308△△▲ 0.2588±0.0122*△△▲XBJIH 0.2003±0.0451*△△ 0.3022±0.0292**△△N

Fig.1 Expression of NF-κB p65 protein and TLR4 protein in each group of rat myocardial tissues

2.3 各組大鼠心肌組織中 NF-κ В p65及 TLR4 mRNA表達(dá)的變化

XBJI可使缺氧/復(fù)氧心肌組織 NF-κ В p65及TLR4 mRNA的表達(dá)減少，且以XBJIM減少最多(表3，圖 2)。

Tab.3 Expression of NF-κ Вp65mRNA and TLR4mRNA inmyocardial tissue of each group(，n=6)

Tab.3 Expression of NF-κ Вp65mRNA and TLR4mRNA inmyocardial tissue of each group(，n=6)

N:Normal group;BP:Balanced perfusion group;M:Model group;XBJIL:Low dose XBJI group;XBJIM:Middle dose XBJI group;XBJIH:High dose XBJI group;XBJI:Xuebijing injection;NF-κ β :Nuclear factor kappaβ ;TLR4:Toll like receptor 4**P＜0.01 vs N group;#P＜0.05 ，##P＜0.01 vs BP group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs M group

Group NF-κ В p65 TLR40.384±0.201**## 0.316±0.059**#XBJIL 0.296±0.102**## 0.227±0.043**△XBJIM 0.193±0.020△△ 0.178±0.055△△XBJIH 0.219±0.030△△ 0.196±0.085△△0.092±0.023 0.131±0.046 BP 0.142±0.020 0.166±0.036 M N

Fig.2 Expression of NF-κB p65 mRNA and TLR4 mRNA in rat myocardial tissues in every group

2.4 相關(guān)性分析結(jié)果

IL-1β濃度與NF-κ Вp65 蛋白 、TLR4 蛋白之間呈正相關(guān)(P＞0.05);IL-1β濃度與NF-κ Вp65 mRNA、TLR4 mRNA之間呈顯著正相關(guān)(P＜0.05);NF-κ В p65 蛋白與 TLR4 蛋白 、NF-κ Вp65 mRNA、TLR4 mRNA之間呈顯著正相關(guān)(P＜0.01);TLR4蛋白與NF-κ Вp65 mRNA 、TLR4 mRNA 之間呈顯著正相關(guān)(P ＜0.01);NF-κ Вp65 mRNA 與TLR4 mRNA 之間呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)。

2.5 各組大鼠心肌組織光學(xué)顯微鏡下病理形態(tài)的比較

N組與BP組心肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，細(xì)胞核居中，心肌纖維正常，未見炎性細(xì)胞浸潤(圖3N、3BP，“實箭頭”示心肌，“虛箭頭”示血管，下同)。M組心肌細(xì)胞腫脹變形，出現(xiàn)空泡變性，細(xì)胞核邊集，心肌纖維斷裂溶解，血管擴(kuò)張明顯且有出血，炎性細(xì)胞浸潤(圖3M，“三角形”示血管內(nèi)出血)。XBJI處理后，上述改變得到明顯的改善，以XBJIM組最為明顯，心肌細(xì)胞接近正常，排列緊密，心肌纖維走形正常，血管擴(kuò)張現(xiàn)象明顯緩解，幾乎無出血，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象減輕(XBJIL、XBJIM、XBJIH)。

Fig.3 Change of rat myocardial tissue under light microscope of all groups

3 討論

本實驗光鏡結(jié)果顯示:M組心肌結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞腫脹、空泡化、細(xì)胞核邊集、心肌纖維斷裂溶解、炎性細(xì)胞浸潤;XBJI處理后心肌結(jié)構(gòu)損傷得到明顯改善，以4 ml/100ml的XBJI最為顯著。表明XBJI對缺氧/復(fù)氧大鼠心肌具有一定程度的保護(hù)作用。

IL-1β是介導(dǎo)炎性反應(yīng)的重要因子[4];NF-κB是參與免疫與炎性反應(yīng)的重要的轉(zhuǎn)錄因子[5];TLR是一類天然免疫受體，TLR4是介導(dǎo)內(nèi)毒素/脂多糖應(yīng)答的主要受體，TLR4-NF-κB 參與炎性反應(yīng)[6]，抑制TLR4--NF-κB通路，可以使大鼠心肌缺血/再灌注損傷減輕[7]。已有文獻(xiàn)報道:血必凈注射液可下調(diào)促炎介質(zhì)IL-1β水平，改善微循環(huán)和組織灌注，保護(hù)重要臟器功能，阻斷SIRS惡性發(fā)展及MODS形成[8];亦可通過抑制參與炎性反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合活性而達(dá)到抵抗炎癥的效果[9];另外，還可通過下調(diào)TLR4蛋白及TLR4 mRNA水平抑制下游細(xì)胞因子的釋放[10]。

本實驗結(jié)果顯示:與M組相比，XBJIL組和XBJIM組心肌組織IL-1β濃度明顯下降(P＜0.01);XBJIL組、XBJIM組、XBJIH組均明顯降低心肌組織NF-κ Вp65及TLR4蛋白表達(dá)(P ＜0.05，P ＜0.01);XBJIM組 、XBJIH組均明顯降低NF-κ Вp65 mRNA 的表達(dá)(P＜0.01);XBJIL組、XBJIM組、XBJIH組均顯著降低TLR4 mRNA的表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)。說明XBJI可降低 IL-1β濃度和下調(diào) NF-κ Вp65及 TLR4蛋白、mRNA表達(dá)而減輕缺氧/復(fù)氧大鼠心肌的炎性反應(yīng)。另外，XBJIL組和XBJIM組 IL-1β濃度明顯低于XBJIH組(P＜0.05)，XBJIL組和 XBJIM組之間IL-1β濃度無差異;XBJIM組NF-κ Вp65蛋白及TLR4蛋白水平明顯低于XBJIL組(P＜0.05)，XBJIM組與XBJIH組之間NF-κ Вp65蛋白及 TLR4蛋白表達(dá)無差異;XBJIL組 、XBJIM組 、XBJIH組之間 NF-κ Вp65 mRNA及TLR4 mRNA雖沒有差異(P＞0.05)，但以XBJIM組NF-κ Вp65 mRNA、TLR4 mRNA 表達(dá)最低 。 提示XBJI對缺氧/復(fù)氧大鼠心肌的保護(hù)作用可通過抑制大鼠心肌的炎性反應(yīng)來實現(xiàn)，以4 ml/100ml的XBJI作用最為明顯。

本研究相關(guān)分析顯示:IL-1β濃度與NF-κ Вp65、TLR4蛋白之間呈正相關(guān);IL-1β 濃度與 NF-κ Вp65、TLR4 mRNA之間呈顯著正相關(guān)(P＜0.05);NF-κ В p65 蛋白與 TLR4 蛋白 之間、NF-κ В p65mRNA 與TLR4 mRNA之間呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)。反映了大鼠心肌缺氧/復(fù)氧引起的炎性反應(yīng)可能與TLR4--NF-κ В--IL-1β 信號通路的活化有關(guān)，XBJI可通過抑制該通路活化減輕大鼠心肌的炎性反應(yīng)。

綜上所述，不同劑量XBJI可通過抑制TLR4--NF-κ В--IL-1β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減輕缺氧/復(fù)氧大鼠心肌的炎性反應(yīng)，以4ml/100ml的XBJI療效最佳。這為XBJ的臨床應(yīng)用提供了可靠的實驗依據(jù)和理論依據(jù)。

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