盧彥珍，王 佳，宋 娟，張翠英，冀菁荃，李寶紅，田小霞，宋曉亮

近些年來，隨著冠狀動脈搭橋術和經皮冠狀動脈腔內成形術等冠脈再通術的迅速開展，緩解了缺血性心血管疾病，卻帶來了副作用即再灌注性損傷，它不但損傷心肌本身，還損傷了心肌間質。心肌間質構成一個復雜、廣泛的膠原網絡，將心肌細胞連接在一起，使單個心肌細胞和肌束的機械收縮偶連在一起，從而協(xié)調心肌的收縮和舒張。膠原的破壞必將影響心肌功能。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是結構上與鋅相關的肽鏈內切酶家族，是細胞外基質的主要生理性調節(jié)物質，在基質成分合成和降解的過程中起著重要的作用。有研究報道［1］，心肌MMPs于心肌缺血早期即被激活，通過對心肌膠原的分解代謝，參與心肌缺血／再灌注損傷過程。大量研究表明缺血后處理（ischemic postconditioning，IPTC）具有明顯縮小心肌梗塞面積、抗再灌注心律失常、改善心功能等與缺血預處理（ischemic postconditioning，IPC）相似的抗心肌缺血／再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）損傷保護作用［2，3］，但目前的研究基本上集中在對心肌細胞的保護上，我們前期的研究顯示［4］，IPTC對心肌間質有保護，但對MMPs有何影響未見報道。本研究旨在探討IPTC對I／R大鼠基質金屬蛋白酶-2的影響，并觀察其與心肌間質和心功能的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 瓊脂糖購自 Promega公司，羊抗鼠MMP-2多克隆抗體、鼠抗小鼠β-actin單克隆抗體、堿性磷酸酶標記的二抗IgG購自Santa Cruz公司，RT-PCR檢測試劑盒購自Takara公司。

1.1.2 動物分組和模型制備 雄性SD大鼠24只，體重（250±30）g，用 20%的烏拉坦（1g／kg ip）麻醉后隨機分為 3組（n＝8）：⑴缺血／再灌注（I／R）組，結扎左冠狀動脈前降支20 min，解除結扎灌注40 min；⑵假手術對照（sham control，SC）組；右冠狀動脈前降支僅穿線不結扎。⑶缺血后處理（IPTC）組，按Zhao［5］等的方法復制缺血后處理動物模型，即缺血畢，再灌注30 s、缺血30 s，連續(xù)3個循環(huán)，然后再灌注40 min結束實驗。復制模型的可靠性用連續(xù)監(jiān)視心電圖Ⅱ導聯(lián)的變化來判斷，結扎后心電圖ST段抬高，解除結扎血管復通后ST段下降1／2以上為模型成功。

1.2 方法

1.2.1 左室功能測定 從右頸總動脈插入 PE-50軟質塑料導管至左心室，接壓力傳感器，經生理儀輸出左心室壓力（left ventricular pressure，LVP）信號，接計算機程序處理后，記錄各組缺血前和再灌注40 min左心室峰壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室內壓上升及下降最大速率（the maximum rate of left ventricular pressure rise and fall，±dp／dt max）及Ⅱ導心電圖。

1.2.2 心肌中膠原含量測定 按文獻方法［6］稱取凍存左室心肌約100 mg，脫水、脫脂、烘干、稱重，加入 6 mol／L HCl 3 ml，105℃烘箱烤 16 h。冷卻后調pH為 6，加去離子水至 10 ml，以 3 500×g，10 min離心，取2 ml上清液做檢測。按要求配制標準管和空白管，用 Beckman紫外分光光度計，波長550 nm，1 cm光徑，水調零，測各管A值，計算出羥脯氨酸含量。由于羥脯氨酸在膠原中占13.4%，心肌膠原含量（mg／g干重心?。搅u脯氨酸含量 ×7.46。

1.2.3 血漿MDA含量及SOD活性測定 各組于實驗結束時，分別從左頸總動脈取血2 ml，以2 000×g，10 min離心分離血漿，硫代巴比妥酸法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。

1.2.4 Western blot免疫印跡檢測各組心肌 MMP-2蛋白的表達變化 取液氮凍存心肌勻漿、離心，取上清得MMP-2提取液，用Bradford法蛋白定量，每泳道取20μg蛋白于8%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，將蛋白轉移至PVDF膜上。加入多克隆羊抗鼠MMP-2的抗體 IgG（終濃度為 mg／L），37℃孵育 2 h，洗滌后，加入堿性磷酸酶標記的MMP-2兔抗山羊單克隆 IgG（1∶1 000稀釋），37℃孵育 2 h，洗滌后，按試劑盒說明染色后拍照分析。

1.2.5 逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法檢測MMP-2mRNA在心肌的表達 采用Trizol一步法提取心肌組織總RNA，用紫外分光光度儀行RNA定量檢測。MMP-2及內參照β-actin引物參照基因庫基因序列設計。引物序列MMP-2（327 bp）上游引物5＇-CACCTATACCAAGAACTTCC-3＇，下 游 引 物 5＇-AACACAGCCTTCTCCTCCTG-3＇；β-actin（233 bp）上游引物5＇-GGACTTCGAGCAGGAGATGG-3＇，下 游 引 物 5＇-GCACCGTGTTGGCGTAGAGG-3＇。取 2μg總 RNA行RT-PCR，94℃變性 40 s，54℃ 退火 1 min，72℃延伸1.5 min，經35個循環(huán)。取10μl RT-PCR產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，利用Quantity One凝膠分析系統(tǒng)對擴增產物條帶進行掃描，計算MMP-2 mRNA相對于內參β-actin的表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗所得數據以均數±標準差（ˉx±s）表示，用SPSS14.0軟件包進行統(tǒng)計分析。多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較應用q檢驗。

2 結果

2.1 IPTC對心肌I／R損傷時心臟動力學參數的影響

心臟動力學參數是代表心臟功能的重要指標。I／R組左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室內壓最大上升速率（maximum rate of intraventricular pressure rise，±dp／dt max）低于假手術組，兩者相比有顯著差異（P＜0.01），說明 I／R組心臟功能明顯受損；IPTC組三項指標明顯高于I／R組（P＜0.05，P＜0.01，表 1），表明 IPTC組心臟功能明顯改善。

Tab.1 Effects of IPTC on dynamic parameters of rat heart in three groups（ˉx±s，n＝8）

2.2 大鼠心肌膠原含量和血漿MDA含量、SOD活性的變化

I／R組心肌膠原含量明顯減少，血漿MDA含量增高，SOD活性降低，與SC組比較差異有顯著性（P＜0.05，P＜0.01）。而與 I／R組相比，IPTC組心肌膠原含量明顯升高，血漿MDA含量降低而SOD活性增強（P＜0.05，P＜0.01，表 2）。

Tab.2 Changes of myocardial collagen fibers and MDA、SOD of plasma among three groups

2.3 Western blot、RT-PCR測定 MMP-2表達結果

Western blot結果顯示，缺血20 min再灌注40 min后，心肌組織中 MMP-2（3.6±0.98）表達較對照組明顯升高（P＜0.01），IPTC組 MMP-2（2.3±0.71）的表達顯著降低（P＜0.01，圖 1）。RT-PCR法檢測MMP-2 mRNA表達，SC組有少量MMP-2 mRNA表達（0.25±0.08），I／R組心肌表達明顯增多（0.89±0.06），而 IPTC組表達明顯低于 I／R組（0.53±0.09）（P＜0.01，圖 2、圖 3）。

Fig.1 Expression of MMP-2 proteinSC：Sham control：I／R：Ischemic／reperfusion；IPTC：Ischemic postconditioning；MMP-2：Matris matris metalloproteinase-2

Fig.2 RT-PCR of MMP-2 in SC group，I／R group and IPTC groupSC：Sham control：I／R：Ischemic／reperfusion；IPTC：Ischemic postconditioning；MMP-2：Matris matris metalloproteinase-2

Fig.3 RT-PCR of MMP-2 mRNA of SC group，I／R group and IPTCgroupMMP-2：Myocardium matris metalloproteinase-2；SC：Sham control；I／R：Ischemic／preperfusion；IPTC：Ischemic postcnditioning**P＜0.01 vs SCgroup；＃＃P＜0.01 vs I／R group

3 討論

隨著心血管疾病，特別是缺血性心臟病發(fā)病率的升高，缺血性心臟病已成為嚴重危害人類健康的心血管流行病。盡快開通閉塞的冠狀動脈，有效恢復缺血心肌的血液灌注，是減少缺血心肌細胞損傷和恢復心肌收縮功能的根本措施，也是限制和縮小梗死面積、改善預后的關鍵所在。但隨著急性心肌梗死的溶栓以及經皮冠狀動脈介入術等有效恢復缺血心肌血液供應的治療技術的興起，大量基礎和臨床研究證實，缺血心肌的再灌注本身也會誘發(fā)一系列新的病理生理變化，進一步加重心肌細胞損傷，出現(xiàn)再灌注心律失常、心肌舒縮功能障礙、代謝異常以及心肌超微結構改變等，即發(fā)生心肌的缺血／再灌注損傷，直接影響病人的預后。因此，如何減輕缺血／再灌注損傷、最大限度保護缺血心肌、是有效治療缺血性心臟病的關鍵。

由Zhao等［5］于 2003年首先提出的 IPTC，具有明顯縮小心肌梗塞面積、抗再灌注心律失常、改善心功能等與IPC相似的抗缺血／再灌注損傷作用［2］，且由于其可控性好，操作方便引起廣大心血管病學者的興趣，但目前的研究基本上集中在對心肌細胞的保護上。心肌是由心肌細胞和心肌胞外間質成分（extracellular，ECM）構成，ECM是維護心臟結構和功能完整性不可缺少的重要組成部分［7］，對心肌細胞起支持、保護、營養(yǎng)、潤滑和制約作用，心肌間質的損傷必將導致心臟形態(tài)改變和功能障礙。

心肌間質主要由膠原纖維及糖蛋白組成，膠原中I型膠原占80%～85%，Ⅲ型占11%，其余是少量的Ⅳ、V、Ⅵ膠原。這些膠原在心肌細胞間組成精細的網狀結構。其主要功能有：（1）包繞在心肌細胞周圍，為心肌細胞提供支撐網架，并在心肌細胞和毛細血管之間起連接作用；（2）形成心室的骨架組織，協(xié)調心肌收縮所產生張力的傳導；（3）膠原纖維自身與心肌纖維呈現(xiàn)一定的排列方向，有利于防止心肌細胞錯位，重排及肌節(jié)過度伸展，維持心室的幾何形狀；（4）膠原纖維還可在心肌收縮期貯存能量，有利于心室舒張期充盈的伸展。已有研究表明，心肌缺血／再灌注后，雖然沒有心肌細胞的壞死，血液供應也得到了恢復，但心肌舒縮功能尚不能及時恢復，其原因可能與心肌間質的損傷、降解有關。Zhao等［8］用掃描和透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn) I／R后心肌的膠原支架稀疏，不連續(xù)或缺失，包繞心肌細胞束的膠原網松散或缺失。

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組能特異地降解細胞外基質成分的鋅（Zn2＋）依賴的酶家族，主要分為膠原酶、明膠酶、基質溶解素及膜型MMPs等幾類，其主要功能是參與細胞外基質的降解，可降解除多糖以外的所有ECM。最近大量動物及臨床研究發(fā)現(xiàn)MMPs的表達及活性增強與心肌缺血／再灌注損傷有著密切的關系。

本實驗結果顯示，I／R組心肌MMP-2蛋白活性和MMP-2 mRNA的表達均明顯升高，這與文獻報道一致［9］。同時，心肌羥脯氨酸含量明顯降低，表明心肌缺血／再灌注后膠原降解。在心肌膠原含量明顯減少時，心功能三項指標LVSP、±dp／dt max明顯低于假手術組（P＜0.01），表明MMP-2的釋放和活性的增加與心肌間質的破壞和心功能損害有明顯的相關性。與I／R組比較，IPTC組MMP-2活性和MMP-2 mRNA的表達均顯著降低（P＜0.01），在 MMP-2降低的同時，心肌膠原含量增加，反映心臟收縮功能的LVSP、＋dp／dt max及反映心臟舒張功能的-dp／dt max明顯改善（P＜0.05，P＜0.01），提示 ITPC具有抑制MMP-2的表達和活性的作用，且對心肌的保護作用之一可能是通過抑制MMP-2的活性和表達，減輕了心肌間質的損傷實現(xiàn)的。

IPTC抑制I／R心肌MMP-2的活性和表達增加的機制尚不清楚。有研究表明心臟在缺血／再灌注后產生大量氧自由基，氧自由基可誘導基質金屬蛋白酶原的構象改變，使其暴露催化部位而激活［10］。我們發(fā)現(xiàn)I／R組MMP-2的活性和MMP-2 mRNA表達增加的同時，血漿中的SOD也明顯降低而MDA明顯升高，提示缺血／再灌注過程中體內氧自由基增加或清除能力不足必將導致心肌基質金屬蛋白酶激活，使心肌膠原降解和破壞。而IPTC的心肌保護作用可能在于增加了SOD的活性，增強了機體的抗氧化能力，穩(wěn)定了基質金屬蛋白酶，從而減少心肌間質膠原的降解而保護了心臟功能。

綜上所述，本研究結果顯示：（1）MMP-2的表達及活性增強是心肌缺血再灌注心肌間質損傷的機制之一。（2）IPTC對心肌的保護作用之一可能是通過減少自由基產生，抑制MMP-2的活性和表達，減輕了心肌間質的損傷而實現(xiàn)的。

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