夏小慧，楊愛宏，胡 揚(yáng)

KCNJ11基因編碼內(nèi)向整流型鉀離子通道蛋白Kir6.2，主要存在于心肌、骨骼肌、胰腺β-細(xì)胞、腦神經(jīng)元等處［1，2］。細(xì)胞內(nèi) ATP／ADP的變化、4，5-二磷酸肌醇以及長(zhǎng)鏈乙酰輔酶A均能激活該通道。在運(yùn)動(dòng)過程中，能合理調(diào)節(jié)心臟對(duì)外界應(yīng)急反應(yīng)的適應(yīng)能力，被認(rèn)為是心臟的能量感受器。

KCNJ11基因位于11p 15.1區(qū)域，僅1個(gè)外顯子，無內(nèi)含子，編碼一個(gè)390個(gè)氨基酸的多肽。E23K多態(tài)（rs5219，C595T）是位于該基因外顯子處的錯(cuò)義突變。該基因編碼蛋白是一種ATP敏感性鉀離子通道，與能量代謝密切相關(guān)。大量研究表明，E23K多態(tài)與糖尿?。?］、心血管疾病［4］密切相關(guān)。我們推測(cè)，E23K變異可能會(huì)改變蛋白質(zhì)性質(zhì)，從而改變鉀離子通道的電流。在此假設(shè)前提下，本研究利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，分析攜帶不同等位基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞膜表面電流密度的影響，以探討E23K多態(tài)與相關(guān)疾病關(guān)聯(lián)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒提取試劑盒、PCR試劑盒購自sangon公司；Taq聚合酶、Pfu酶、EcoR I、Xba I限制性內(nèi)切酶等購自Progema公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素、胰蛋白酶等購自 Giboc公司；氯化鈉、氯化鉀、EDTA、HEPES、氯化鎂、D-葡萄糖等購自Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

感受態(tài)細(xì)胞TOP10購自Novasygen公司，pcDNA3.1／CT-GFP質(zhì)粒載體由蘭州獸醫(yī)研究所人獸共患病研究室惠贈(zèng)。健康人基因組DNA由本課題組前期保存。

1.2 KCNJ11基因的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)已發(fā)表的 GenBank（NCBI Reference Sequence：NM-000525.3）中的 KCNJ11序列設(shè)計(jì)引物F、R，上下游引物 5＇端分別加載 EcoR I和 Xba I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。以健康人基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增KCNJ11基因外顯子。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，通過連接、轉(zhuǎn)化后插入pcDNA3.1／CT-GFP載體。測(cè)序得到多態(tài)位點(diǎn)為G（對(duì)應(yīng)于氨基酸E）的重組載體。載體命名為 pcDNA3.1-KCNJ11（E）（圖 1）。

Fig.1 Restriction endonuclease digestion confirmations of recombinant plasmid1：Digestion fragments by EcoR I and Xba I；M：DNA marker

根據(jù)突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)突變引物Fm和Rm。以pcDNA3.1-KCNJ11（E）為模板，以 F和 Fm、R和 Rm引物對(duì)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物I和產(chǎn)物II經(jīng)純化后等比例混合。取混合物為模板，以F和R引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，純化回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后插入 pcDNA3.1／CT-GFP載體。測(cè)序得到多態(tài)位點(diǎn)為A（對(duì)應(yīng)于氨基酸K）的重組載體。載體命名為pcDNA3.1-KCNJ11（K）。本研究所用引物序列見表1。

Tab.1Primers for amplification

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HEK293T細(xì)胞在 DMEM培養(yǎng)基中（含 10%FBS），37℃，5%CO2，100%相對(duì)濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)2×105cells／ml時(shí)，用重組質(zhì)粒（除去內(nèi)毒素）pcDNA3.1-KCNJ11（K）、pcDNA3.1-KCNJ11（E）分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染試劑為 Lipofectamine 2000，轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后24～48 h在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，選邊緣整齊、表面光滑，有綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)行電生理測(cè)定。

1.4 電生理記錄

配制細(xì)胞外液（mmol／L：NaCl：140，KCl：5.4，Ca：1.8，MgCl2：0.5，NaH2PO4：0.33，HEPES：5，葡萄糖：5.5，用 NaOH調(diào) pH 7.4）、細(xì)胞內(nèi)液（K：130，MgCl2：1，磷酸肌酸二鈉鹽：5，天冬氨酸：90，EGTA：10，HEPES：5，用 KOH調(diào) pH 7.4）。通過三維操縱儀（MP285R，Sutter）使電極與細(xì)胞表面形成高阻封接及全細(xì)胞記錄模式，電流信號(hào)經(jīng)Axon 700B放大器（Axon）進(jìn)行處理。鉗制電壓為由-150 mV至60 mV，階躍電壓：10 mV，采樣時(shí)間：250 ms。采樣頻率：5 KHz。用pClamp9軟件（Axon）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。由電流振幅與電容的比值計(jì)算電流密度（pA／pF）。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的獲得和表達(dá)載體的構(gòu)建

成功擴(kuò)增到大小為1 173 bp的片段，并將其插入pcDNA3.1載體。測(cè)序結(jié)果表明，與GenBank公布的KCNJ11基因序列相比，同源性為99.6%（圖1）。

圖 2所示為構(gòu)建的 pcDNA3.1-KCNJ11（E）、pcDNA3.1-KCNJ11（K）重組質(zhì)粒部分測(cè)序圖，箭頭所示為突變位點(diǎn)。結(jié)果表明，構(gòu)建的兩個(gè)載體僅有突變位點(diǎn)差異，其余序列均一致。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，平均轉(zhuǎn)染率為13.6%。內(nèi)有綠色熒光者表示已轉(zhuǎn)染并KCNJ11基因成功表達(dá)的細(xì)胞（圖3）。

Fig.2 Sequenced recombinant plasmid fragments

Fig.3 HEK293T cells after transfected

2.3 細(xì)胞膜電流密度測(cè)定

全細(xì)胞膜片鉗記錄結(jié)果顯示，pcDNA3.1-KCNJ11（E）轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中記錄到了相對(duì)較強(qiáng)的電流，而pcDNA3.1-KCNJ11（K）轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中記錄到的電流明顯弱（圖4）。

Fig.4 Currents in transfected cell was investigated using patch clampA：pcDNA3.1-KCNJ11（E）；B：pcDNA3.1-KCNJ11（K）

當(dāng)鉗制電壓為由-150 mV漸變?yōu)椋?0 mV，根據(jù)電流隨電壓的變化繪制電壓電流關(guān)系曲線（圖5）。電流正值為外向電流，電流負(fù)值為內(nèi)向電流。在兩種不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的HEK 293T細(xì)胞中，其細(xì)胞膜的反轉(zhuǎn)電位約為-50 mV，內(nèi)向電流與外向電流大小相近。而在pcDNA3.1-KCNJ11（K）轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中，內(nèi)向電流和外向電流均明顯減少。T-檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組細(xì)胞表面電流對(duì)比有顯著性差異（P＜0.05）。

Fig.5 I／V curves of ATP-sensitive K＋（KATP）channels after transfected difference recombinant plasmids（n＝10）

3 討論

KCNJ11基因編碼的Kir6.2蛋白分布于心肌、骨骼肌、平滑肌、內(nèi)分泌細(xì)胞等，其生理功能是維持細(xì)胞靜息電位，調(diào)節(jié)骨骼肌、血管平滑肌的舒縮等，并參與多種生理功能：如胰腺胰島素的分泌、心肌缺氧的保護(hù)功能等。鉀離子通道的特征是其開放活性受胞內(nèi)ATP的調(diào)節(jié)，ATP及磺酰脲類藥物抑制其開放，而ADP及其它二磷酸核苷促其開放。KCNJ11基因編碼蛋白的通道上，發(fā)現(xiàn)許多影響ATP敏感性的氨基酸位點(diǎn)和區(qū)域［5］，如 R50、K185、R201、G334等四個(gè)位點(diǎn)共同形成一個(gè)ATP結(jié)合槽，其中任何一個(gè)氨基酸的改變會(huì)使通道對(duì)ATP的敏感性極大降低，甚至消失。

體外表達(dá)系統(tǒng)是研究離子通道電流特征的一個(gè)重要途徑［6］，而膜片鉗技術(shù)被認(rèn)為是研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”。離子通道的特征，一定程度上依賴于使用的表達(dá)系統(tǒng)。如植物鉀離子通道蛋白KAT1在蛙卵中的激活電位接近-80 mV，而在昆蟲細(xì)胞中的接近-60 mV［7］。本實(shí)驗(yàn)中，測(cè)到的細(xì)胞膜電流較小，最大為20 pA／pF，最小為-23 pA／pF。這可能與表達(dá)載體的類型、轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)。由于本研究?jī)山M轉(zhuǎn)染質(zhì)粒只有一個(gè)位點(diǎn)差異，其余條件均一致，因此對(duì)比兩組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的電生理功能，結(jié)果可靠。

E／K突變是KCNJ11基因中研究最多的多態(tài)位點(diǎn)。大多數(shù)研究認(rèn)為該位點(diǎn)多態(tài)與糖尿病相關(guān)聯(lián)，但結(jié)果又不盡一致［8，9］。對(duì)各獨(dú)立研究進(jìn)行合并統(tǒng)計(jì)分析，提示KCNJ11基因KK基因型可能是Ⅱ型糖尿病發(fā)病的危險(xiǎn)因子［10］。通過構(gòu)建分子模型顯示，Kir6.2通道結(jié)構(gòu)中，E23殘基在胞內(nèi)功能性的α-螺旋區(qū)，而E殘基被K取代后，該氨基酸殘基帶有相反的電荷，有可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)重排以及Kir6.2亞基相鄰的內(nèi)部結(jié)構(gòu)斷裂，特別是在純合子狀態(tài)下，這種作用更為明顯。也有研究認(rèn)為，由于KATP通道是由一個(gè)內(nèi)向整流性鉀通道（Kir6.2或Kir6.1）和一種 ATP結(jié)合蛋白—磺酰脲類受體（SUR1或SUR2）組成的異聚體［11］，在 ABCC8基因（編碼 SUR1蛋白）上有一個(gè)敏感的S1369A多態(tài)位點(diǎn)，是KCNJ11基因E23K位點(diǎn)與ABCC8基因S1369A位點(diǎn)共同作用改變了離子通道的ATP敏感性［12］。還有研究認(rèn)為，鉀離子通道電流的變化依賴于ABCC8中A1369變異的存在，而不是KCNJ11中K23［7］。而在本研究中，兩個(gè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒只有E／K位點(diǎn)不同，其余條件均相同，而檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞表面電流發(fā)生了明顯變化，說明E23K多態(tài)位點(diǎn)單獨(dú)可以改變離子通道的功能，從而改變細(xì)胞相關(guān)特性。

總之，人 KCNJ11基因 E23K通過異源表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，細(xì)胞表面電流發(fā)生了明顯改變，表明KCNJ11基因外顯子E23K多態(tài)能導(dǎo)致細(xì)胞膜電流發(fā)生改變。為進(jìn)一步研究多態(tài)位點(diǎn)與相關(guān)疾病的關(guān)聯(lián)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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