俞愛月，蘇巧榮，王 嵐，周 瑾，劉學(xué)紅

（1.紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院心理教研室，2.實驗中心，3.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，浙江紹興312000）

慢性應(yīng)激可使大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)發(fā)生改變，也是抑郁障礙發(fā)生的重要因素之一［1］，據(jù)報道，這可能與神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）的下調(diào)，原癌基因蛋白（protoogene protein，C-fos）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等表達(dá)水平改變有關(guān)［2］。而目前對于反映細(xì)胞增殖狀況的可靠指標(biāo)，即增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在慢性應(yīng)激引起的額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制尚缺乏研究。據(jù)報道，文拉法辛、帕羅西汀等藥物對慢性應(yīng)激大鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用［3］。筆者的前期研究表明：慢性應(yīng)激可通過影響大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的Bcl-2、Bax表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；西酞普蘭可調(diào)節(jié)慢性應(yīng)激大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的Bcl-2、Bax表達(dá)水平，拮抗細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生保護(hù)作用［4］。在此基礎(chǔ)上，本文對慢性應(yīng)激大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡與PCNA、C-fos表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行研究，進(jìn)一步闡明西酞普蘭干預(yù)慢性應(yīng)激引起的額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，從而為臨床預(yù)防和治療精神心理疾患提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性SD大鼠（購自于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心）24只，體重（238±21）g。

1.1.2 藥物 氫溴酸西酞普蘭：商品名為喜普妙（西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)）。

1.1.3 試劑 PCNA與C-fos免疫組化試劑盒、缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）所用試劑，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠飼養(yǎng)及動物模型的建立 按不同分組進(jìn)行分箱飼養(yǎng)，每組8只，每箱4只，共6箱，允許其自由飲水進(jìn)食。適應(yīng)7 d后，開始實驗。飼養(yǎng)環(huán)境為光、暗各 12 h，光照時間為 8∶00-20∶00，室內(nèi)溫度為（22.5±2.3）℃。對照組為空白組，無任何處理；西酞普蘭＋慢性應(yīng)激的實驗組采取4 mg／kg·d西酞普蘭灌胃；慢性應(yīng)激組應(yīng)用等體積生理鹽水灌胃（我們的前期研究及相關(guān)學(xué)者也運用此分組方法）［5、6］。將后兩組置于80 cm×40 cm×40 cm的水缸中，其水深 25 cm、水溫（20.5±2.3）℃，每天強(qiáng)迫游泳 14～16 min，連續(xù)28 d建立慢性應(yīng)激模型。

1.2.2 標(biāo)本制備 造模成功后1 d，用2%戊巴比妥鈉以60～70 mg／kg給予腹腔麻醉，開胸后經(jīng)左心室快速灌注37℃生理鹽水（含適量肝素）共（120±20）ml，然后灌注4%中性多聚甲醛溶液（采用磷酸鹽緩沖液 PBS配制，pH 7.4，含 1／1 000的 DEPC）200～250 ml，30～40 min后取出鼠腦前額組織，并置于4%中性多聚甲醛溶液中固定。常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～6μm。

1.2.3 免疫組化染色和細(xì)胞凋亡檢測 免疫組化染色采用PV法，細(xì)胞凋亡檢測采用缺口末端標(biāo)記法。兩者均要求切片常規(guī)脫蠟至水，然后進(jìn)行微波修復(fù)5 min，再用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PV法則是在上述基礎(chǔ)上滴加Ⅰ抗（濃度1∶120），濕盒為37℃、60 min→滴加抗體 IgG（Fab段）→HRP多聚體，濕盒37℃20 min→DAB顯色（以上各步間用PBS洗滌3次，每次5 min）→蘇木精輕度復(fù)染，并脫水透明，然后用中性樹膠封片，通過光鏡觀察。陽性細(xì)胞判別：細(xì)胞膜／細(xì)胞質(zhì)可見棕色、黃色、淡黃色陽性顆粒，深淺不一；而細(xì)胞凋亡檢測則加用試劑1和2混合液（1∶9）→濕盒 37℃ 60 min→滴加轉(zhuǎn)化劑—POD 37℃、30 min→DAB顯色→蘇木精輕度復(fù)染，中性樹膠封片，通過光鏡觀察。陽性凋亡細(xì)胞判別：呈圓形、橢圓形、月牙形或不規(guī)則形的核濃縮，顏色深淺不一，呈棕色或黃色。用已知陽性片做陽性對照，用標(biāo)記液代替TUNEL反應(yīng)液做陰性對照。

1.2.4 電鏡標(biāo)本 首先固定標(biāo)本，其次進(jìn)行梯度脫水、包埋、切片、載網(wǎng)、染色（檸檬酸鉛、醋酸鈾），最后通過電鏡進(jìn)行觀察。陽性細(xì)胞判別：細(xì)胞核皺縮，體積變小。早期核膜濃縮，核膜內(nèi)分界不清，核仁濃縮；中期核膜變形呈不規(guī)則形或呈鋸齒狀，晚期核膜邊界不清或核膜消失。

1.2.5 圖像分析 運用日本尼康圖像分析（NIS DR）軟件，對額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞PCNA、C-fos蛋白表達(dá)，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。每只大鼠隨機(jī)取切片2～3張，顯微鏡下分別選取2個視野（×400）

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，所得結(jié)果均以（）形式表示，采用單因素方差分析進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法PCNA、C-fos蛋白表達(dá)光鏡觀察結(jié)果

陽性細(xì)胞胞核呈黃色或棕色、胞質(zhì)不著色。應(yīng)激組與對照組比較，可見少量PCNA表達(dá)陽性細(xì)胞、大量C-fos表達(dá)陽性細(xì)胞；而實驗組與應(yīng)激組比較，可見PCNA表達(dá)陽性細(xì)胞增多、C-fos表達(dá)陽性細(xì)胞較少（圖1，表1，圖1見彩圖頁Ⅱ）

2.2 額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況

慢性應(yīng)激組陽性細(xì)胞的體積比對照組小，細(xì)胞核發(fā)生濃縮的情況明顯，形態(tài)上呈橢圓形、月牙形或不規(guī)則形，顏色呈棕黃色或黃色，亦可以看到大量凋亡小體；實驗組可以發(fā)現(xiàn)少量陽性細(xì)胞，核濃縮現(xiàn)象較應(yīng)激組明顯減輕，染色也明顯變淡（圖2，見彩圖頁Ⅱ）。與應(yīng)激組比較，對照組與實驗組PCDA，C-fos陽性細(xì)胞數(shù)增加，TUNEL陽性細(xì)胞減少（P＜0.05，P＜0.01，表 1）。

2.3 額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果

對照組大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞核大且圓，核膜完整，異染色質(zhì)位于核膜下方，常染色質(zhì)位于核仁周圍，核仁位于核中央，結(jié)構(gòu)正常。應(yīng)激組皮質(zhì)額葉可以看到較多的神經(jīng)細(xì)胞核發(fā)生皺縮，體積也逐漸減小，核膜變形呈不規(guī)則形或呈鋸齒狀，晚期核膜邊界不清或核膜消失。實驗組大鼠細(xì)胞核皺縮的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，較應(yīng)激組明顯減少，小部分細(xì)胞核膜或核仁也有濃縮，但大部分神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞核大且圓，核膜完整，結(jié)構(gòu)正常（圖3）。

Tab.1 Changes of PCDA，C-fos and TUNEL positive cells in each group

Fig.3 Frontal cortex neurons in electron microscopy（×8 000）

3 討論

強(qiáng)迫游泳是公認(rèn)的建立抑郁應(yīng)激模型的方法，在抑郁癥的實驗研究中應(yīng)用廣泛［7］。大鼠懸尾實驗和力竭游泳實驗均可客觀地反映動物體能狀態(tài)及“失望”情緒，是較為經(jīng)典的反映大鼠心理抑郁程度的行為學(xué)評價方法［8］。我們的研究成功制造了慢性應(yīng)激大鼠模型，間接提示西酞普蘭能有效緩解心理抑郁、改善體力不足狀態(tài)［9］。

PCNA是一種分子量為36 kD的蛋白質(zhì)，存在于細(xì)胞核內(nèi)，與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，為DNA聚合酶δ的輔助蛋白。其陽性表達(dá)強(qiáng)弱代表細(xì)胞增殖活動的高低，是目前公認(rèn)反映細(xì)胞增殖狀況的可靠指標(biāo)［10，11］。本實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，應(yīng)激組大鼠額葉皮質(zhì)PCNA蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞減少，提示慢性應(yīng)激可誘導(dǎo)DNA損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞的增殖；實驗組大鼠額葉皮質(zhì)PCNA蛋白表達(dá)高于應(yīng)激組，這可能與保護(hù)性反應(yīng)、增殖修復(fù)的調(diào)節(jié)功能激活有關(guān)，而這一功能的激活可能與適量使用西酞普蘭有關(guān)，提示西酞普蘭對神經(jīng)細(xì)胞增殖具有激活作用。

至于不同劑量西酞普蘭的作用結(jié)果，實驗過程已設(shè)置低（1 mg／kg·d）、中（4 mg／kg·d）、高（8 mg／kg·d）三個不同劑量組，限于文章篇幅，選擇典型中等劑量組進(jìn)行比較，其余劑量組數(shù)據(jù)將另文發(fā)表。

C-fos是myc癌基因中的成員之一，其在細(xì)胞的分裂、信息傳導(dǎo)調(diào)控等方面，起重要作用［12］。其在哺乳動物組織中表達(dá)率較高，而進(jìn)化使其發(fā)生突變的幾率偏低。在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些部位，神經(jīng)細(xì)胞可有基礎(chǔ)水平的表達(dá)，但水平不高，急性應(yīng)激可誘導(dǎo)C-fos發(fā)生快速、短暫高水平的表達(dá)［13］，而慢性應(yīng)激可維持C-fos蛋白表達(dá)水平。另有研究提示，C-fos的高表達(dá)與凋亡反應(yīng)的高表達(dá)密切相關(guān)，故能有效促使細(xì)胞特異性凋亡［14］。在人體內(nèi)，C-fos蛋白與c-jun蛋白有親緣性，共同組成異源二聚體。此合成物多與DNA結(jié)合，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，發(fā)揮至關(guān)重要的作用。從本次實驗可以看出，應(yīng)激組大鼠額葉皮質(zhì)C-fos蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于空白對照組，與白云峰、王艷等對海馬的研究結(jié)果基本一致［15］。其原因：慢性應(yīng)激可能對大鼠額葉皮質(zhì)導(dǎo)致了器質(zhì)性損害，使其神經(jīng)細(xì)胞功能降低，導(dǎo)致細(xì)胞表型改變。這與本實驗中其余觀測指標(biāo)（即應(yīng)激組大鼠行為的改變、PCNA下調(diào)、TUNEL陽性細(xì)胞增加）顯示結(jié)果一致。提示C-fos一旦表達(dá)，可通過調(diào)控下游靶基因影響細(xì)胞內(nèi)蛋白酶、受體、細(xì)胞因子等的表達(dá)，引起細(xì)胞代謝的紊亂，最后導(dǎo)致細(xì)胞表型改變或凋亡。而實驗組大鼠額葉皮質(zhì)C-fos蛋白表達(dá)低于應(yīng)激組，提示西酞普蘭可能通過對C-fos的調(diào)控拮抗細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果表明慢性應(yīng)激可影響大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞PCNA、C-fos蛋白表達(dá)水平，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也間接證實了西酞普蘭可有效調(diào)控額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞PCNA、C-fos蛋白表達(dá)水平，拮抗細(xì)胞凋亡。

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