都中蕊，李紅芳，△，張 偉，田治峰，邱小青，盧研宇，梁乾坤，汪龍德

（1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機能實驗室，3.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，蘭州730000）

針對治療絕經(jīng)期綜合征的雌激素替代療法目前存在許多爭議，不當使用雌激素可能導(dǎo)致宮頸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等疾病的發(fā)病率增加［1-3］，對雌激素的研究和應(yīng)用還有待于進一步深入。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可改變黏附連接分子復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，進而影響細胞間的黏附以及血管通透性［4］。在該復(fù)合體結(jié)構(gòu)中，鈣黏蛋白（E-cadherin）、α-連環(huán)蛋白（α-catenin）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是三種重要的黏附連接蛋白，通過其相互作用使相鄰細胞緊密連接在一起［5］。體內(nèi)雌激素異常而誘發(fā)雌激素依賴性腫瘤的發(fā)病機制可能與上述黏附連接復(fù)合體有關(guān)，但目前對雌激素引起鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白表達變化的機制尚未完全闡明，因此本實驗主要目的是研究Est對子宮鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白表達的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

17β-雌二醇、他莫昔芬均購自 Sigma公司，α-catenin、βcatenin及內(nèi)參β-actin的單克隆抗體均購自Santa Cruz公司，E-cadherin單克隆抗體購自博奧森公司，SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2 動物分組

選用12周左右健康雌性SD大鼠42只，體重200～230 g，隨機分為7組（n＝6）。麻醉后摘除雙側(cè)卵巢。實驗分組設(shè)計為：假手術(shù)組（Sham）；卵巢切除組（Ovx）；17β-雌二醇低、中、高劑量組 （Ovx＋Est）：Est劑量分別為 0.01 mg／kg、0.1 mg／kg、1.0 mg／kg；17β-雌二醇中、高劑量 ＋他莫昔芬組（Ovx＋Est＋Tam）；Est劑量分別為 0.1 mg／kg、1.0 mg／kg，Tam劑量為

30 .0 mg／kg；隔日皮下注射給藥，21 d后麻醉取子宮組織。

1.3 免疫組化SP法

將子宮組織石蠟切片脫蠟至水、抗原修復(fù)后，按照免疫組化SP試劑盒的說明進行實驗。免疫組化實驗共設(shè)8組，除上述7組外增加一組陰性對照組（即用 PBS替代一抗孵育），結(jié)果判斷：以細胞質(zhì)和（或）細胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒作為陽性細胞，每例標本選取5個高倍鏡視野進行陽性細胞計數(shù)：陽性細胞百分比小于5%為0分，5%～15%為1分，16%～30%為2分，31%～50%為3分，大于50%為4分。同時按著色強度計分：（1）0分：無染色，呈陰性；（2）1分：染色弱，呈淡黃色；（3）2分：染色中等，呈黃色；（4）3分：染色強，呈棕黃色。兩者積分乘積的高低決定陽性與否：0分為陰性（-）；1～4分為弱陽性（＋）；5～8分為中度陽性（＋＋）；9～12分為強陽性（＋＋＋）。

1.4 Western blot法

提取子宮組織總蛋白，進行Western blot法檢測，經(jīng)過制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜后，進行封閉，再經(jīng)過一抗、二抗孵育，最后進行曝光顯影定影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 17β-雌二醇對鈣黏蛋白、連環(huán)蛋白表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示，α-catenin、β-catenin和 E-cadherin三種蛋白在各實驗組中均有表達，主要定位于子宮內(nèi)膜上皮細胞和腺泡上皮細胞的細胞膜和胞漿，β-catenin還有少量表達于細胞核。Sham組上述三種蛋白表達較低；Ovx組子宮萎縮明顯，三種蛋白的表達較Sham組顯著上調(diào)；與Ovx組相比，三種蛋白在Est中、高劑量組的表達均下調(diào)，Est低劑量組的表達與Ovx組無顯著差異（圖1，表1，圖1見彩圖頁Ⅲ）。

Western Blot法檢測α-catenin的表達與免疫組化結(jié)果一致（圖 2）。各組相對灰度值：Sham組0.15±0.008，Ovx組0.74±0.024，Ovx＋Est組 0.80±0.036，Ovx＋Est組 0.2±0.019，Ovx＋Est組 0.31±0.005（圖 2）。

2.2 選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑對雌二醇引起的鈣黏蛋白、連環(huán)蛋白表達下調(diào)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，他莫昔芬對 Est（0.1 mg／kg）引起的α-catenin、β-catenin和 E-cadherin表達下調(diào)具有拮抗作用；而對Est（1.0mg／kg）引起的上述三種蛋白表達下調(diào)則表現(xiàn)出部分協(xié)同作用（圖1，表1，圖1見彩圖頁Ⅲ）。

Tab.1 Statistical analysis of the immunohistochemical staining results ofα-catenin andβ-catenin and E-cadherin in the uterus of rats in different groups（，n＝6）

Tab.1 Statistical analysis of the immunohistochemical staining results ofα-catenin andβ-catenin and E-cadherin in the uterus of rats in different groups（，n＝6）

Ovx：Ovariesctomy；Est：Estradiol；Tam：Tamoxifen**P＜0.01 vs sham group；＃＃P＜0.01 vs Ovx group

Group α-catenin β-catenin E-cadherin Sham 1.333±0.516 3.000±0.632 2.667±0.516 Ovx 10.000±1.549**11.333±1.633**12.000±0**Ovx＋Est 0.01 9.000±1.897**10.667±2.066**9.833±2.563**Ovx＋Est 0.1 1.500±0.548＃＃ 3.167±0.753＃＃ 2.000±0.894＃＃Ovx＋Est 1.0 6.000±1.265＃＃ 6.333±0.816＃＃ 6.333±2.251＃＃Ovx＋Est 0.1＋Tam 10.668±2.066**11.333±1.633**11.500±1.225**Ovx＋Est1.0＋Tam 2.000±0＃＃ 3.333±0.516＃＃ 2.500±0.548＃＃

Fig.2 Results of Western blot ofα-catenin andβ-actin proteins（A）and relative expression level ofα-catenin（B）in uterine tissue of ovariectomized rats

3 討論

鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白在維持血管通透性方面有重要作用［6］，血管通透性由穿細胞途徑和與黏附連接蛋白有關(guān)的細胞旁途徑所決定［7］。本實驗從Est影響細胞旁途徑的角度進行研究發(fā)現(xiàn)，鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白在Est中劑量組和假手術(shù)組子宮組織中的表達無顯著差異，且均表達較低，切除卵巢引起的內(nèi)源性雌激素缺乏會使其表達顯著增高，Est的干預(yù)可使去卵巢大鼠子宮鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白的表達下調(diào)，但無劑量效應(yīng)，推測其原因可能是由于血管通透性不僅與黏附連接分子的表達量有關(guān)，還與黏附連接復(fù)合體結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，復(fù)合體結(jié)構(gòu)中鈣黏蛋白、連環(huán)蛋白和細胞骨架的分離，會破壞內(nèi)皮細胞間的黏附聯(lián)接，引起血管通透性增加。此外，鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白介導(dǎo)細胞粘附，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密不可分，細胞間粘附力的下降有利于腫瘤的轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)βcatenin還參與Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Est可激活該通路使細胞膜上β-catenin與E-cadherin分離，破壞細胞黏附連接，同時，游離在胞漿中的β-catenin進入細胞核，激活癌基因，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［8］。

他莫昔芬是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，具有雙向調(diào)節(jié)作用，可與雌激素競爭性結(jié)合雌激素受體而產(chǎn)生抗雌激素效應(yīng)，或激活雌激素受體而產(chǎn)生雌激素樣作用。我們推測，Tam可干預(yù)Est引起的鈣黏蛋白、連環(huán)蛋白表達下調(diào)作用，故Est對鈣黏連蛋白和連環(huán)蛋白表達的影響機制可能與雌激素受體有關(guān)，Se-Hyung Park等［9］的研究也支持了這一結(jié)論。

通過研究Est對大鼠子宮鈣黏蛋白、連環(huán)蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)其作用機制與雌激素受體有關(guān)，有助于探索雌激素影響血管通透性和細胞黏附的機制，以及雌激素依賴性腫瘤的發(fā)病機制，為臨床腫瘤的防治提供依據(jù)，有利于人們找到新的腫瘤治療方法，同時也為他莫昔芬在雌激素替代療法中的運用提供依據(jù)，但由于雌激素在體內(nèi)的作用十分復(fù)雜，其機制還有待于深入研究。

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