徐志慧 代 勇 孫雪英 韓 韜 梁 昊

1成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院碩士研究生2012級(jí),成都 610075

2成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院副教授,成都 610075

青蒿素(artemisinin，ART)是我國(guó)科學(xué)家在1972年首次從菊科植物黃花蒿中提取的含有過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯類化合物，其衍生物主要有青蒿琥酯(artesunate)、蒿甲醚(artemether)、蒿乙醚(arteether)、雙氫青蒿素(dihydroartemisinin)等，最初開發(fā)運(yùn)用于瘧疾的治療。近期的研究[1]發(fā)現(xiàn)其還有更廣泛的作用，包括抗腫瘤、抗孕、抗纖維化、抗血吸蟲、抗弓形蟲、抗心律失常以及抗細(xì)胞毒性等，其中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其重要的作用機(jī)制。目前研究最多的是青蒿素及其衍生物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。本文針對(duì)青蒿素及其衍生物對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控的實(shí)驗(yàn)和機(jī)制研究作一綜述。

1 細(xì)胞凋亡的概念

細(xì)胞凋亡的概念是病理學(xué)家Kerr等在Cancer雜志上首次提出的。所謂細(xì)胞凋亡是指有核細(xì)胞在一定條件下通過啟動(dòng)其自身內(nèi)部遺傳機(jī)制，主要通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞自然死亡過程[2]。其是程序性細(xì)胞死亡的一種表現(xiàn)形式，也是機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、生理及病理性死亡的重要機(jī)制。細(xì)胞凋亡對(duì)多細(xì)胞生物正常的生理過程，如機(jī)體的發(fā)育、免疫穩(wěn)定、防止器官硬化、抵御病毒入侵、防止細(xì)胞癌變等方面都有著重要的作用。目前針對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究有很多，主要集中在細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制、酶學(xué)機(jī)制、線粒體的作用以及基因調(diào)控機(jī)制幾個(gè)方面。

2 青蒿素及其衍生物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用研究

在青蒿素及其衍生物的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，Moore等[3]首先報(bào)道了聯(lián)合應(yīng)用硫酸亞鐵和雙氫青蒿素可顯著抑制鼠移植性纖維肉瘤的生長(zhǎng)，而單獨(dú)應(yīng)用二者之一則作用不大。馬振秋等[4]報(bào)道5 μmol/L的雙氫青蒿素(DHA)作用于體外培養(yǎng)的大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6細(xì)胞)24 h后，開始抑制C6細(xì)胞的生長(zhǎng)，作用48 h后細(xì)胞凋亡率可達(dá)30%；25 μmol/L的DHA作用48 h后，凋亡率接近50%。郭燕等[5]報(bào)道在誘導(dǎo)小鼠淋巴管瘤形成后，分離并培養(yǎng)小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(LEC)，再用不同濃度的青蒿素(ART)處理后，LEC細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征。戰(zhàn)曉農(nóng)等[6]報(bào)道對(duì)接種人結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞的人結(jié)直腸癌Balb/c裸鼠分別用高、中、低劑量雙氫青蒿素(120，60，30 mg/kg)處理，結(jié)果顯示對(duì)裸鼠移植瘤的抑制率分別為36.54%、26.55%和12.43%，并且高劑量組的Bcl-2的陽性表達(dá)率為63.66%。謝紅等[7]研究雙氫青蒿素對(duì)人白血病細(xì)胞K562細(xì)胞增殖及凋亡的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用不同濃度(1×10-4、1×10-5、1×10-6mol/L)的藥物處理K562細(xì)胞，可見K562細(xì)胞生長(zhǎng)均受到抑制，并呈劑量依賴性；用Hoechst 33342/PI雙熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察到經(jīng)雙氫青蒿素處理細(xì)胞24 h后可見細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；Western blot檢測(cè)顯示，1×10-5mol/L濃度的雙氫青蒿素作用K562細(xì)胞24 h后，可見胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的含量明顯增多，而線粒體中細(xì)胞色素C則明顯減少。孫雅潔等[8]用青蒿素、雙氫青蒿素、蒿甲醚和青蒿琥酯分別體外抑制人肺癌細(xì)胞(A549)、人胃癌細(xì)胞(BGC823)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116)、人紅白血病細(xì)胞(K562)和人肝癌細(xì)胞(SMMC7721)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青蒿素、雙氫青蒿素、蒿甲醚及青蒿琥酯對(duì)5株腫瘤細(xì)胞有選擇性的抑制作用，且對(duì)每株腫瘤細(xì)胞的抑制活性不同。其中，雙氫青蒿素和青蒿琥酯對(duì)5株腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，且青蒿琥酯的抑制作用較強(qiáng)；蒿甲醚對(duì)5株腫瘤細(xì)胞中的BGC823、HCT116和SMMC7721等3株細(xì)胞有不同程度的抑制作用；青蒿素僅對(duì)5株腫瘤細(xì)胞中的SMMC7721有抑制作用，且抑制活性較弱。

同時(shí)，近年來已經(jīng)有一些青蒿素抗腫瘤的臨床應(yīng)用研究。Singh等[9]用蒿甲醚治療1例垂體大腺瘤患者，每日1次，口服蒿甲醚40 mg，12個(gè)月后患者臨床癥狀明顯改善，受損的視力、聽力逐漸恢復(fù)。CT掃描顯示瘤體密度明顯降低，腫瘤體積減小。Berger等[10]用青蒿琥酯輔助標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療2例用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療無法控制病情的晚期轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者，其中1例患者治療期間多次檢查結(jié)果顯示癥狀改善，脾、肺中轉(zhuǎn)移灶消退，47個(gè)月后仍存活，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過晚期黑素瘤患者2～5個(gè)月的中位生存期。國(guó)內(nèi)還有經(jīng)超聲引導(dǎo)瘤體注射青蒿琥酯治療18例原發(fā)性中晚期肝癌的報(bào)道[11]，治療前后比較，其甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平、腫塊大小、回聲改變、肝臟血供等均顯著改善，患者疼痛等癥狀也減輕明顯。張祖貽等[12]在試用青蒿琥酯聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱與順鉑治療中晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組可顯著提高患者的疾病控制率，同時(shí)延長(zhǎng)疾病進(jìn)展時(shí)間。

3 青蒿素及其衍生物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

對(duì)于青蒿素及其衍生物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡尤其是腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，目前尚未完全明了，一般認(rèn)為青蒿素及其衍生物是通過下面幾種方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

3.1 調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)誘導(dǎo)凋亡

研究[13]表明青蒿素類藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能與Bcl-2、Bax、p53等基因有關(guān)。Bcl-2與Bax是Bcl-2家族中功能相反的2個(gè)重要成員，Bcl-2阻止凋亡，Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在陳先國(guó)等[14]的青蒿琥酯對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎滑膜的實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)表明青蒿琥酯可上調(diào)滑膜組織中Fas/FasL、Bax及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，以此來達(dá)到誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡的目的。p53為抑癌基因，其生物學(xué)功能是在G1期監(jiān)視細(xì)胞基因組DNA的完整性，可阻止DNA突變的細(xì)胞通過G1和G2期限制點(diǎn)，誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯于G1期，使這些細(xì)胞凋亡。謝茹燕等[15]用蒿甲醚(ART)作用于人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MKN-45及胰腺癌細(xì)胞株SW-1990和BXPC-3，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5 mg/ml的ART作用于SGC-7901細(xì)胞株，細(xì)胞周期變化主要表現(xiàn)為G0/G1期增加，S期減少；當(dāng)1.25 mg/ml的ART作用于MKN-45、BXPC-3、SW-1990細(xì)胞株，細(xì)胞周期變化也均表現(xiàn)為G0/G1期增加，S期減少。p53是Bcl-2/Bax的上游調(diào)控基因，通過其下游蛋白質(zhì)產(chǎn)物p21WAF1/CIP1 下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax，促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程。但也有研究學(xué)者認(rèn)為p53并非凋亡發(fā)生必不可少的調(diào)控基因。

3.2 激活caspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是一系列胞內(nèi)蛋白水解酶的活化和功能發(fā)揮作用所致，其中caspase活化是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，而caspase-3是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵性的效應(yīng)蛋白酶之一。研究表明，青蒿素及其衍生物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與激活caspase通路有關(guān)。謝紅等[16]在用雙氫青蒿素處理K562細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素處理K562細(xì)胞48 h后，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)可以檢測(cè)到caspase-3的表達(dá)，同時(shí)可以檢測(cè)到胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C(Cyt-C)的含量明顯增多，而線粒體中Cyt-C則明顯減少。由此可以表明雙氫青蒿素在誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞過程中激活了效應(yīng)蛋白酶caspase-3的表達(dá)，同時(shí)可能通過促進(jìn)Cyt-C的釋放，可進(jìn)一步激活caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)來誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。

3.3 線粒體膜電位下降誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

線粒體膜電位是線粒體電化學(xué)梯度的主要組成成分，常態(tài)的膜電位對(duì)維持線粒體功能是必不可少的。線粒體膜電位下降可導(dǎo)致促凋亡物質(zhì)釋放、caspase激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增多。董海鷹等[17]用青蒿素作用于體外培養(yǎng)的人紅白血病K562細(xì)胞，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，在給藥后細(xì)胞線粒體膜電位下降，且呈藥物濃度和作用時(shí)間的依賴關(guān)系。

3.4 端粒酶活性下降誘導(dǎo)凋亡

端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白多聚酶，端粒酶的活化可以彌補(bǔ)復(fù)制造成的端粒縮短，端粒酶活性的增加與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。端粒酶活性下降可以促進(jìn)細(xì)胞的程序性死亡過程，端粒酶活性抑制劑不僅可以增加腫瘤細(xì)胞的凋亡率，而且可以增加其他化療藥物的臨床療效。劉加軍等[18]用不同濃度的青蒿素作用于體外培養(yǎng)的K562細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡逐漸升高，但是細(xì)胞端粒酶活性卻逐漸下降，其中在6 μmol/L的青蒿素引起的端粒酶活性下降最為明顯，而且細(xì)胞凋亡率也相對(duì)較高。

除了通過上述的幾個(gè)機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡之外，青蒿素及其衍生物可能還有其他未知的機(jī)制對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。

4 小結(jié)

綜上所述，細(xì)胞凋亡本身就是一個(gè)很復(fù)雜的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)確定青蒿素及其衍生物確實(shí)可以引起多種細(xì)胞特別是腫瘤細(xì)胞的凋亡，但是其誘導(dǎo)機(jī)制復(fù)雜，涉及到多種凋亡調(diào)控基因、蛋白酶的表達(dá)，以及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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