■ 邢思華 華雪銘朱站英， 黃 衛(wèi) 沈彥萍沈文婧

(1.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海201306；2.泗洪縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站泗洪縣水生動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇宿遷223900；3.杭州?；曙暳祥_發(fā)有限公司，浙江杭州311100；4.上海沈李科工貿(mào)有限公司，上海200436)

作為國際公認的綠色天然酶制劑[1-2]，溶菌酶具有無毒[3]、無害、專一性強[4]的特點，并已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)療[5]、食品[6]等行業(yè)。相關(guān)研究表明，溶菌酶在飼料行業(yè)也有著廣闊的應(yīng)用前景，在部分水產(chǎn)動物飼料中使用[7-8]已取得良好的效果。然而針對水產(chǎn)動物復(fù)雜的營養(yǎng)生理特性[9-12]，漁用飼料高溫高壓的加工工藝特點以及酶制劑易失活的特性[13-14]，飼用溶菌酶在水產(chǎn)飼料中的可行性、穩(wěn)定性和真實有效性還有待進一步驗證。研究采用人工模擬環(huán)境因子的方法探討溶菌酶酶活力受溫度、pH值等因素的影響，評價溶菌酶制品的儲存效果，并通過體外消解法探討溶菌酶制品對魚體內(nèi)源性消化酶的耐受性，為溶菌酶制品的改良及其在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

溶菌酶制品為粉狀脂質(zhì)體，采用薄膜法制備而成。

1.1 溶菌酶制品活性隨儲存時間、溫度和pH值的變化

將溶菌酶制品分裝在自封袋中，放入干燥器，室溫14～26℃保存。保存至60 d和90 d時在pH值7.2、37℃條件下分別測定溶菌酶活力。

以儲存至60 d的溶菌酶制品為試驗材料，在37℃及不同pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0與8.0[15]）條件下測定溶菌酶活力。將溶壁微球菌接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h，用上述不同pH值的PBS沖洗菌落[16]，轉(zhuǎn)移至離心管，3 000 r/min離心1 min，棄上清液后，再用相應(yīng)的PBS重新混勻溶壁微球菌，使懸濁液的透光度在0.4左右；同時用相應(yīng)pH值的PBS溶解溶菌酶制品(0.01 g/ml)。

以保存至90 d的溶菌酶制品為試驗材料，在pH值7.2及不同溫度條件下測定溶菌酶活力。使用恒溫水浴鍋將溫度分別控制在14、20、30、40、50、60、70、80、90℃和99℃。用pH值7.2的 PBS溶解溶菌酶制品(0.01 g/ml)、制備透光度約0.4的溶壁微球菌懸濁液。

溶菌酶活力測定：溶菌酶制品溶液50 μl和溶壁微球菌菌液3 ml在冰水浴條件下混勻，于570 nm處測量透光度，然后在試驗設(shè)定溫度條件下水浴30 min，混勻冰水浴20 min以終止反應(yīng)，570 nm處測量透光度。溶菌酶活力計算公式如下：

1.2 含溶菌酶制品的飼料耐擠壓和耐高溫特性

將溶菌酶制品按300 mg/kg的添加量與基礎(chǔ)飼料原料（魚粉6.2%、豆粕23.4%、菜籽粕18.9%、小麥麩15.0%、次粉15.0%、米糠5.0%、面粉11.7%、磷酸二氫鈣1.5%、氯化膽堿1.0%、大豆油1.0%、復(fù)合多維0.5%、復(fù)合礦物質(zhì)0.5%、食鹽0.3%）逐級混合后加10%蒸餾水，取一部分經(jīng)絞肉機兩次擠壓，測定擠壓前后的溶菌酶活力；另取一部分密閉在自封袋內(nèi)，放入烘箱，80℃加熱2 h，待冷卻后破碎，過60目篩絹，用無菌的pH值7.2 PBS溶解，靜置20 min，反復(fù)混勻，3 000 r/min離心10 min后，取上清液在37℃條件下測定溶菌酶活力[17]。

1.3 體外消化試驗

取草魚（Ctenopharyngodon idellus）、鯽魚（Caras?sius auratus）和鯉魚（Cyprinus carpio）的肝胰臟和腸道不同部位（去腸道內(nèi)容物），用pH值7.2的PBS漂洗后，吸干水分，裝入1.5 ml離心管待用。

用pH值7.2的PBS將肝胰臟和腸道勻漿后(質(zhì)量體積比1∶10)，3 000 r/min離心1 min，取上清液即為粗酶液；將粗酶液稀釋100倍后與儲存60 d的溶菌酶制品的PBS溶液(0.01 g/ml)37℃預(yù)熱后按體積比1∶9混合，混勻反應(yīng)30 min，測定溶菌酶制品與粗消化酶液反應(yīng)前后的溶菌酶活力。

試驗魚規(guī)格：草魚(0.021 kg/尾)、鯉魚(0.52 kg/尾)、異育銀鯽(0.15 kg/尾)。溶菌酶測定方法參照1.1。

1.4 含溶菌酶制品的儲存試驗

在基礎(chǔ)飼料原料(同1.2)中分別添加100、200、300、400 mg/kg與500 mg/kg溶菌酶制品(分別稱為100、200、300、400、500飼料組)，用實驗室小型制粒機加工成直徑為1.5 mm的顆粒飼料，密閉、干燥、常溫(14～30℃)保存，參考沈明泉等的方法[18]每隔30 d在37℃條件下測定溶菌酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶菌酶制品活性在不同溫度和pH值條件下的變化（見圖1～圖2）

圖1 溶菌酶制品酶活力隨溫度變化

圖2 溶菌酶制品酶活力隨pH值變化

從圖1可以看出，該溶菌酶制品的溶菌酶活力隨溫度升高呈現(xiàn)先升高后降低的顯著變化（P＜0.05），峰值出現(xiàn)在70℃。常溫與高溫條件下的溶菌酶活力無顯著差異（P＞0.05），表明該溶菌酶制品對高溫具有比較強的耐受能力，可以承受飼料加工過程中的調(diào)質(zhì)處理。程建軍等[14]研究表明，未包被的蛋殼溶菌酶最適溫度在50℃左右，在50℃時抑菌效果最佳，而本試驗結(jié)果顯示，該溶菌酶的最適溫度在70℃附近，說明包被處理能在一定程度上提高溶菌酶的耐高溫性能。而在不同的pH值(3.0～8.0)條件下，溶菌酶活力變化不顯著(見圖2)，說明該溶菌酶制品在理論上可以適應(yīng)不同水產(chǎn)動物、不同消化道pH值的變化。這與賴曉芳等[19]的研究結(jié)果基本一致。

2.2 含溶菌酶制品的飼料耐擠壓和耐高溫特性(見表1)

表1 飼料加工環(huán)境模擬對飼料溶菌酶活力的影響

含溶菌酶飼料經(jīng)擠壓和高溫處理，溶菌酶活性從處理前的(0.64±0.01)×106U/g變化到(0.62±0.02)×106U/g和(0.55±0.01)×106U/g，但處理前后無顯著差異(P＞0.05)，說明該溶菌酶制品對飼料加工過程有較好的耐受性。

2.3 消化酶對溶菌酶制品的體外消化（見圖3）

圖3 三種魚類腸道和肝胰臟粗酶液對溶菌酶制品酶活力的影響

飼料中所添加的外源溶菌酶在水產(chǎn)動物機體內(nèi)能否最大程度耐受內(nèi)源消化酶的消化分解，保持其自身的酶活性，是提高外源溶菌酶使用效果的重要影響因素[15]。從圖3可以看出，魚類消化道所分泌的消化酶對溶菌酶制品活力的影響因魚的種類以及消化道位置的不同而不同，總體而言，外源溶菌酶在魚類消化道中被不同程度地消化，且在中腸處溶菌酶的酶活損失較大，這可能與不同魚類的食性及消化道不同部位的結(jié)構(gòu)特點有關(guān)，具體原因有待進一步研究。鑒于溶菌酶對魚類消化酶相對有限的耐受性，改進溶菌酶制品的包被技術(shù)對提高外源溶菌酶的使用效果具有重要意義。

2.4 含溶菌酶制品飼料與溶菌酶制品的儲存試驗

在0～90 d的保存期內(nèi)，單獨存放的溶菌酶制品酶活力顯著降低(P＜0.05，見圖4)。當(dāng)溶菌酶制品添加在配合飼料中時（見表2），隨著保存時間的延長，飼料中的溶菌酶活力逐漸降低。100 mg/kg組酶活變化出現(xiàn)一個折線趨勢，即0～30 d有較大的酶活變化，30～60 d出現(xiàn)一個穩(wěn)定時期，60～90 d后又出現(xiàn)一個酶活下降時期。200、300和400 mg/kg組的酶活在30 d以后保持相對穩(wěn)定。

圖4 溶菌酶制品酶活力隨儲存時間變化

表2 飼料中溶菌酶活力隨儲存時間的變化（×106U/g）

相比較而言，溶菌酶制品單獨存放較添加到飼料中更容易造成溶菌酶活力的降低。其可能原因是單獨存放的溶菌酶制品需要應(yīng)對環(huán)境的作用，而添加在飼料中的溶菌酶制品被飼料原料中的蛋白、脂肪等包裹，形成的“保護層”使溶菌酶制品與空氣接觸的機會大大減少[18]，因此其活力變化比單獨存放時相對穩(wěn)定。另外，飼料中的溶菌酶活性雖然隨儲存時間的延長有不同程度的降低，但水產(chǎn)養(yǎng)殖季節(jié)性明顯，飼料保存周期相對較短，因此，該溶菌酶制品符合漁用飼料的儲存要求，具有較大的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

本研究所用漁用溶菌酶制品具有耐高溫、耐擠壓、對酸堿度不敏感等特點；添加溶菌酶制品的飼料在3個月后仍能保持35%～45%的溶菌酶活性。鑒于溶菌酶制品在魚類消化酶作用下會被部分分解，有必要對溶菌酶制品的包被技術(shù)進行研究。