劉 浩，周建偉，張 瑛，尚占環(huán)，米見對，龍瑞軍＊

（1.蘭州大學草地農業(yè)科技學院，蘭州730000；2.蘭州大學青藏高原生態(tài)系統(tǒng)管理國際中心，蘭州730000；3.蘭州大學生命科學學院，蘭州730000）

藏羊（ovis aries）是我國三大原始綿羊品種之一，是藏族人民在特殊自然環(huán)境下長期選育而成的主要畜種［1］。青藏高原是全球海拔最高地區(qū)，素有“世界屋脊”之稱［2］，具有年平均氣溫低（－1 ℃至－5℃）、牧草生長期極短（6月至9月）、牧草生物量季節(jié)變動大的特點［3］。藏羊獨特的生物學特征和生理學機制，恰好適應青藏高原嚴酷的自然環(huán)境和傳統(tǒng)粗放的管理方式［4］。據張瑛等［5］報道，與其他綿羊相比，藏羊具有較低的氮素維持需要量的特點，這可能是經過長期進化，藏羊與生活在同一環(huán)境的牦牛一樣進化出了比其他低海拔反芻家畜更有效地利用飼糧中的氮以保證生存的特殊機制［6－10］，瘤胃微生物蛋白是反芻動物蛋白質的主要來源［11－12］，PD 法估測瘤胃微生物蛋白因其操作簡單、準確而又非損害性的特點［13－14］，在20世紀80、90年代受到國外反芻動物學者的青睞。但PD 法估測瘤胃微生物蛋白的研究在我國起步較晚，相關研究相對較少［15］，尤其是關于藏羊尿中嘌呤衍生物排出量的研究未見報道。本試驗通過研究燕麥干草不同限飼水平對藏羊尿中馬尿酸、肌酐、PD 及其各組分排出量響應的影響，為估測藏羊瘤胃微生物蛋白產量及揭示氮代謝機制提供依據，為青藏高原藏羊的生產實踐提供科學合理的技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

燕麥干草限飼及絕食試驗在甘肅省天祝藏族自治縣安遠鎮(zhèn)蘭州大學青藏高原生態(tài)系統(tǒng)管理國際中心烏鞘嶺實驗站（北緯37°12.479′，東經102°51.695′，海拔3 154m）進行，后期樣品分析于2013年2～6月在蘭州大學青藏高原生態(tài)系統(tǒng)管理國際中心實驗室進行。

1.2 試驗概況

選取5頭體重為（45±2）kg的20月齡、健康的去勢公藏羊作為試驗動物，為了更好地開展試驗以及減少藏羊試驗中的應激性，保證數據可靠性，在試驗正式開始前，對藏羊進行為期20d的適應期，以便其熟悉生活環(huán)境、飼養(yǎng)人員及其他實驗設施。

1.3 試驗設計

本研究分為限飼試驗和絕食試驗兩個階段。首先開展限飼試驗，分成4個試驗期進行，每期為21 d，包括預試期15d和正試期6d。限飼期內，試驗動物每天08∶00和18∶00各飼喂1次，自由飲水。待藏羊體況恢復后開展絕食試驗，共18d，前10d為預試期，按藏羊維持水平飼喂飼糧600g／d（干物質，DM 基礎），正試期8d，第1天飼喂量減至0.6倍維持水平，第2天減至0.3倍維持水平，第3～6d完全絕食，第7～8d分別恢復至0.3倍維持水平、0.6倍維持水平，絕食期間自由飲水。根據預試期確定45kg藏羊自由采食量（VI）為1000g／d，設置4個飼喂水平，分別為30%（304.28g，0.3VI組）、50%（505.96g，0.5VI 組）、70%VI（707.64g，0.7VI）、90%VI（912.85g，0.9VI組）。4×4 拉丁方試驗設計（見表1）。

1.4 試驗飼糧與飼養(yǎng)管理

試驗飼糧為單一的燕麥青干草，用鍘草機處理成長度1～2cm 以方便飼喂。飼糧營養(yǎng)物質含量（風干基礎）：干物質（dry matter，DM）88.5%；有機物（organic matter，OM）82.9%；中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）含量53.1%；酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量39.8%；鈣含量0.39%；磷含量0.18%。具體飼料組成和自由采食水平見表2。

表1 試驗設計Table 1 Experiment design

表2 試驗飼糧組成和自由采食水平（干物質基礎）Table 2 Composition and daily intake level of the experimental diets（DM basis）

1.5 樣品采集

限飼試驗開始后的第16d，即正試期第1d的08∶00（飼喂前）開始采用全收糞尿法，連續(xù)收集5 d，并記錄每天每頭藏羊的排尿量、排糞量，將每天收集的尿樣混勻，按總尿量的10%取樣，用50%的硫酸溶液酸化，使pH＜3.0，以利于固定尿中NH3－N和避免微生物生長，并在－20 ℃的冰柜中保存，每期試驗結束后，將5d的糞樣制成混合樣。

1.6 樣品分析

藏羊尿液中嘌呤衍生物各組分、肌酐、馬尿酸的排出量采用安捷倫LC1200 型高效液相色譜儀測定，方法參照李曉鵬等［16］HPLC法測定。

1.7 數據統(tǒng)計

所有試驗數據用Excel 2010版軟件進行整理、繪圖；用SPSS17.0 進行One－way ANOVA 和雙變量PEARSON 系數分析。

2 結果

2.1 嘌呤衍生物及肌酐、馬尿酸排出量及占總PD比重

由表3知，尿中PD 包括尿囊素、尿酸、次黃嘌呤、黃嘌呤。隨著限飼水平降低，尿中PD 各組分、馬尿酸及總PD 排出量線性增加（P＜0.05），尿囊素在總PD 中所占比重也線性增加（P＜0.01），而尿酸、次黃嘌呤＋黃嘌呤在總PD 中所占比重線性減?。≒＜0.01）；次黃嘌呤、黃嘌呤單獨計算時數值較小且不方便，將次黃嘌呤＋黃嘌呤作為一個指標處理，PD 各組分占總PD 的比重分別為尿囊素66.6%～73.8%，次黃嘌呤＋黃嘌呤為13.5%～18.9%，尿酸為11.2%～14.4%，且隨著限飼水平降低，尿囊素占總PD 比重升高，尿酸和次黃嘌呤＋黃嘌呤占總PD 比重均下降；當限飼水平超過0.5VI時，尿囊素比重差異不顯著（P＞0.05），較高限飼水平的三組與0.3VI 組的尿囊素比重差異顯著（P＜0.05）。

表3 燕麥干草不同限飼水平對尿中PD、肌酐、馬尿酸排出量及PD 比重的影響Table 3 Effect of different restricted feeding levels of oat hay on urinary excretion of PD，creatinine，hippuric acid and percentage of PD

2.2 嘌呤衍生物各組分、總PD、肌酐、馬尿酸之間相關性分析

由表4可知，嘌呤衍生物各組分與總PD 之間呈極顯著性相關關系（P＜0.01），馬尿酸與尿囊素、總PD 之間呈顯著相關關系（P＜0.05），肌酐與PD各組分、總PD、馬尿酸之間不相關（P＞0.05）。

表4 嘌呤衍生物各組分、總PD、肌酐、馬尿酸之間相關性分析Table 4 Correlations among components of PD，total PD，creatinine and hippuric acid

2.3 可消化有機物采食量（DOMI）與尿中馬尿酸、總PD 排出量的關系

由圖1、圖2可知，總PD 排出量（mmol／d）與可消化有機物采食量（DOMI，kg／d）線性相關（P＜0.05），其關系式為：總PD（mmol／d）＝14.066DOMI（kg／d）＋1.5262，（n＝20，R2＝0.9883）；馬尿酸排出量（g／d）與可消化有機物采食量（DOMI，kg／d），其關系式為：馬尿酸排出量（g／d）＝19.365DO－MI（kg／d）＋3.6437（n＝20，R2＝0.9666）。

2.4 絕食期內源嘌呤衍生物動態(tài)變化

由圖3 可知，隨著絕食時間的延長，尿中尿囊素、尿酸、次黃嘌呤＋黃嘌呤以及總PD 排出量均呈現(xiàn)先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢，尿囊素動態(tài)變化與總PD 基本一致，絕食后第4～6d嘌呤衍生物排出量基本達到穩(wěn)定水平且在第5d時排出量最低，據此可以計算出內源PD的每天排出量為1.95mmol／d。

圖1 可消化有機物采食量與總PD 排出量關系Fig.1 The relationship between DOMI and excretion of total PD

圖2 可消化有機物采食量與馬尿酸排出量關系Fig.2 The relationship between DOMI and excretion of hippuric acid

圖3 藏羊絕食期尿液PD 排出量Fig.3 Urinary PD excretion during the fasting period in Tibetan sheep

3 討論

尿囊素是哺乳動物嘌呤代謝的終產物［17］。對反芻動物而言，尿中嘌呤衍生物來源于被宿主吸收的瘤胃微生物蛋白［18－19］及自身組織蛋白的嘌呤代謝，而后者所占的比重很?。?1］。因此，Topps和Elliott推斷［20］反芻動物尿中尿囊素的排出量與其瘤胃微生物之間具有某種關系，該假設后來在黃牛［21］、水牛［22］、牦牛［7，9］、綿羊［23］、山羊［24］上被證實并建立了有機物采食量與尿中嘌呤衍生物排出量的相關模型。

3.1 燕麥干草不同飼喂水平對藏羊尿中PD、肌酐、馬尿酸排量的影響

3.1.1 嘌呤衍生物 本試驗中，尿中PD 及各組分排出量隨著限飼水平降低而增加，這與王永新等［25］和徐萍等［26］得出的結論一致。尿中PD 各組分排出量對各限飼水平的響應表明，尿中PD（主要為尿囊素）排出量對采食量非常敏感；當采食水平大于0.5VI時，藏羊尿中尿酸排出量相對穩(wěn)定；而尿中黃嘌呤＋次黃嘌呤排出量對采食量的敏感性介于前兩者之間。與Chen等［11］在綿羊上的結果相似，隨著限飼水平的降低，尿中尿囊素在總PD 中的比重增加，而尿酸、黃嘌呤＋次黃嘌呤的降低。當飼喂水平大于0.3VI 時，尿中尿囊素比重相對穩(wěn)定，在71.38%～73.82%之間；當飼喂水平大于0.3VI時，尿中黃嘌呤＋次黃嘌呤比重相對穩(wěn)定，在13.5%～15.02%之間；當飼喂水平小于0.9VI時，尿中尿酸比重相對穩(wěn)定，在12.80%～14.39%之間。反芻動物尿中PD 的主要成分是尿囊素，其次為尿酸，最后是黃嘌呤＋次黃嘌呤［27－28］，本試驗藏羊尿中PD尿囊素含量低于黃牛［21］、牦牛［7，9］、及綿羊［29］上的研究結果，但Chen等［30］在綿羊中得出的結果相近。據報道，黃牛尿液PD 中黃嘌呤＋次黃嘌呤含量相對較低，基本可以忽略不計［28］，Chen等［30］測得綿羊尿液PD 中黃嘌呤＋次黃嘌呤含量在10.15%～15.00%之間，略低于本試驗研究結果。因此，藏羊尿液PD 中相對較高的黃嘌呤＋次黃嘌呤含量和相對較低的尿囊素含量，可能是由于其體內血液、肝臟和腸道粘膜細胞中較低黃嘌呤氧化酶活性，致使藏羊體內次黃嘌呤、黃嘌呤沒有完全轉化成尿囊素。

3.1.2 肌酐 肌酐是肌酸和磷酸肌酸代謝的終產物，它主要由肌肉中磷酸肌酸的非酶促反應生成，再釋放到血液中，隨尿排泄。反芻動物尿中肌酐排出量與體重［31］、肌肉含量［32］、品種及生理期［9］等因素有關，而不受飼糧的影響，即使在代謝體重基礎上，體重較大的動物尿中排出肌酐多［33］。本試驗同樣表明尿中肌酐排出量不受日糧的影響，因此肌酐通常作為一種穩(wěn)定的內標物來測定腎小球率過濾，Chen等［34］報道綿羊尿中肌酐排出量的均值為0.46 mmol／（kg BW0.75·d），Hovell等［35］報道綿羊尿中肌酐排出量為0.43～0.47mmol／（kg BW0.75·d），楊膺白等［36］在對波爾山羊研究時測出肌酐量為0.46～0.48mmol／（kg BW0.75·d），本試驗中藏羊在不同限飼水平下尿中肌酐排出量的范圍為0.40～0.42mmol／（kg BW0.75·d），與上述結果相近。

3.1.3 馬尿酸 馬尿酸是苯甲酸和甘氨酸在肝臟中結合的產物，對防治草食動物苯甲酸中毒具有重要意義［37］。本研究中，隨著限飼水平升降低，藏羊尿中馬尿酸排出量線性增加，表明馬尿酸排出量與飼糧攝入量有關，目前對于馬尿酸的研究及應用較少，僅在牛奶受尿液污染方面有過報道［38］。

3.2 嘌呤衍生物各組分、總PD、肌酐、馬尿酸的相關性研究

反芻動物體內的核酸和嘌呤底物在核苷磷酸化酶的作用下降解為黃嘌呤和次黃嘌呤，再被黃嘌呤氧化酶降解為尿酸，然后進一步降解為尿囊素［11］，由此可見，尿中PD 及各組分之間可能存在某種相關關系，本試驗中尿囊素、尿酸、次黃嘌呤＋黃嘌呤、總PD 四個指標兩兩之間存在正相關關系也恰好驗證了這一觀點。馬尿酸和尿中PD 及尿囊素呈正相關，因此，通過建立某種模型，只要測得其中一個指標即可以推測另外兩個指標的數據，使工作量大大減小。尿中馬尿酸、PD 及其組分均受日糧水平的影響，而尿中肌酐不受日糧影響，因此，肌酐與馬尿酸、PD 及其組分不相關。

3.3 可消化有機物采食量（DOMI）與總PD、馬尿酸排出量的關系

采食量是影響動物尿中PD，馬尿酸排出量的重。尿中PD 排出量隨DOMI 的增加而線性增加［7，9，39］，本試驗中，總PD 排出量（mmol／d）與可消化有機物采食量（DOMI，kg／d）的關系式為：總PD（mmol／d）＝14.066DOMI（kg／d）＋1.5262，（n＝20，R2＝0.9883）。當DOMI＝0 時，PD＝1.53 mmol／d［即0.09mmol／（kg BW0.75·d）］，該值可用于內源嘌呤衍生物排出量的估測；馬尿酸排出量與DOMI具有很好的相關性，其關系式為馬尿酸排出量（g／d）＝19.365DOMI＋3.6437（n＝20，R2＝0.9592），其在測定采食量及預測尿中PD 排出量等方面都有潛在的應用價值，有待深入研究。

3.4 絕食期藏羊內源PD

本試驗測得藏羊內源PD 排出量為1.95 mmol／d［即0.11mmol／（kg BW0.75·d）］，與通過尿中PD 和DOMI所建立模型估測值接近。據Chen等［30］報道綿羊平均每天排出內源PD 為0.15 mmol／（kg BW0.75·d），Lindberg［40］報道山羊內源PD 排出量為0.19mmol／（kg BW0.75·d），Soejono等［41］報道黃牛每天排出內源PD 為0.13～0.14 mmol／（kg BW0.75·d），而藏羊內源PD 排出量均低于上述所選動物，可能是藏羊與生活在同一生境的牦牛一樣，進化出了特殊的腎臟調控機制［42］，以適應青藏高原牧草長期匱乏的現(xiàn)狀。

4 結論

限飼水平與馬尿酸、PD 及各組分排出量呈負相關，但與肌酐排出量無相關性；利用PD 與DOMI建立的模型估測出內源PD 排出量與內源PD 實際排出量接近，驗證了模型的準確性。

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