鄧紅惠，耿果霞，賀亞媚，江中良，石美虹，陳華麗，李青旺＊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

卵巢是母畜重要生殖器官之一，顆粒細(xì)胞是卵巢的主要功能細(xì)胞，其增殖分化直接影響卵泡發(fā)育、排卵啟動(dòng)、黃體形成及類固醇激素的合成分泌等功能［1］。近年來以顆粒細(xì)胞作為生殖研究模型受到研究者越來越多的青睞。外源或內(nèi)源物質(zhì)通過與顆粒細(xì)胞相互作用進(jìn)而影響卵巢生殖功能，甚至直接作用（Porter等［2］與Basini等［3］對(duì)催乳素的研究）。Jackowska等［4］研究發(fā)現(xiàn)不同直徑卵泡中卵母細(xì)胞的多種基因表達(dá)不同，為探究不同直徑范圍的有腔卵泡中顆粒細(xì)胞質(zhì)量是否相同，本試驗(yàn)將豬有腔卵泡按直徑分為大中小三種類型并獲得相應(yīng)顆粒細(xì)胞進(jìn)行分析，以期為后續(xù)生殖毒理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

成年豬卵巢采集自雨潤集團(tuán)楊凌萬盛屠宰場(chǎng)。DMEM／F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司，MTT，DMSO，Insulin 及BSA 購自Sigma 公司，RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄試劑購自TAKARA 公司，熒光定量試劑均購自Vazyme公司，F(xiàn)SH（100IU／支）購自寧波第二激素廠。

1.2 方法

1.2.1 卵巢顆粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 從屠宰場(chǎng)獲取成年豬卵巢，置于37 ℃含1%青鏈霉素的生理鹽水中，30 min 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。滅菌清洗后，借鑒Jiang 等［5］的方法，剖剪出卵巢內(nèi)三種直徑范圍的有腔卵泡（＜2 mm，2～5 mm，≥5 mm），分別置于DMEM／F12中，并清洗3次。轉(zhuǎn)移入60 mm 無菌平皿，十字狀剪破卵泡，使卵泡液充分流出，400目篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞混合液，800r／min離心5min，洗滌顆粒細(xì)胞3次。用添加0.3%BSA，50ng／mL胰島素，0.1IU／mL FSH，3% FBS，100IU／mL 青霉素，100mg／ml鏈霉素的DMEM／F12完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105／mL后接種于培養(yǎng)板，置于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 卵巢顆粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率、純度計(jì)算 將充分混勻的細(xì)胞懸液取出100μL，與0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液按9∶1混勻，臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活性，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在3min內(nèi)完成計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞活率；采用剖剪法、400目過濾所得的細(xì)胞中有兩種類型細(xì)胞，一種是數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的呈圓形或類圓形細(xì)胞，另一種是極少數(shù)的纖維狀細(xì)胞，在顯微鏡下觀察形態(tài)計(jì)算圓形和類圓形細(xì)胞所占的百分比，以初步計(jì)算細(xì)胞純度。

1.2.3 顆粒細(xì)胞鑒定FSHR基因特異性表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞［6］，故可用于顆粒細(xì)胞的鑒定；LHR基因能反映顆粒細(xì)胞所處階段黃體化程度，故可用于衡量顆粒細(xì)胞變性情況。設(shè)計(jì)特異性引物（表1），進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析以鑒定顆粒細(xì)胞。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 的特異性引物Table 1 The primer sequences used in real－time quantitative PCR analysis

1.2.4 細(xì)胞生長曲線測(cè)定 將細(xì)胞以5×105個(gè)／mL密度接種于96孔板，8個(gè)復(fù)孔，200uL／孔，采用MTT 方法于24，48，72，96，120，144h檢測(cè)OD490。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD490光吸收值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬有腔卵泡分級(jí)

剖剪出卵泡液透亮的有腔生長卵泡，卵泡細(xì)化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：小型卵泡＜2mm，中型卵泡2～5mm，大型卵泡≥5mm。

圖1 不同級(jí)別的豬卵泡1.小卵泡；2－5.中型卵泡；6－8.大型卵泡Fig.1 Different types of procine follicle1.Small follicles；2－5.Middle follicles；6－8.Large follicles

2.2 卵巢顆粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率計(jì)算、純度估算

采用機(jī)械剖剪法及過濾等獲得的三種直徑有腔卵泡顆粒細(xì)胞得率高，活率均超過68%，純度達(dá)到90%以上（表2）。

表2 不同直徑卵泡中所獲得顆粒細(xì)胞的活率與純度Table 2 The yield，viability and purity of granulosa cells from three follicles of different diameters

2.3 顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

新分離的豬卵巢顆粒細(xì)胞呈圓形或類圓形單個(gè)分散存在，進(jìn)行培養(yǎng)24h后，細(xì)胞開始單層貼壁生長（圖2）；36h后開始鋪展呈團(tuán)樣集落生長（圖3），48h后集落樣的數(shù)量增多，出現(xiàn)成串細(xì)胞群（圖4）；培養(yǎng)96h聚集生長現(xiàn)象明顯，鳥巢狀的細(xì)胞團(tuán)塊增加（圖5）。

圖2 培養(yǎng)24h的豬卵巢顆粒細(xì)胞（200×）Fig.2 Porcine granulosa cells nurtured for 24h（200×）

圖3 培養(yǎng)36h的豬卵巢顆粒細(xì)胞（200×）Fig.3 Porcine granulosa cells nurtured for 36h（200×）

圖4 培養(yǎng)48h的豬卵巢顆粒細(xì)胞（200×）Fig.4 Porcine granulosa cells nurtured for 48h（200×）

圖5 培養(yǎng)96h的豬卵巢顆粒細(xì)胞（200×）Fig.5 Porcine granulosa cells nurtured for 96h（200×）

2.4 細(xì)胞生長曲線測(cè)定

細(xì)胞生長曲線（圖6）表明，24h前細(xì)胞處在貼壁適應(yīng)期，1d后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，OD值明顯增加，細(xì)胞大量增殖，判斷細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，并于第5d達(dá)到最高密度，說明細(xì)胞在此時(shí)生長極度旺盛。

2.5 顆粒細(xì)胞鑒定

2.5.1 形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下觀察豬顆粒細(xì)胞，形態(tài)呈圓形或類圓形。

2.5.2 實(shí)時(shí)定量結(jié)果 實(shí)時(shí)定量結(jié)果（圖7）顯示，三種不同直徑卵泡中獲得的顆粒細(xì)胞中FSHR基因表達(dá)陽性，LHR基因也檢測(cè)到表達(dá)。小型卵泡中顆粒細(xì)胞的FSHR的表達(dá)量最高且LHR的表達(dá)量最低，大型和中型卵泡中獲得的顆粒細(xì)胞FSHR的表達(dá)差異不顯著（P＞0.05），而LHR基因在大型卵泡中表達(dá)顯著高于中型卵泡（P＜0.05）。

3 討論

圖7 不同直徑卵泡顆粒細(xì)胞FSHR 及LHR 表達(dá)L.大型卵泡中顆粒細(xì)胞；M.中型卵泡中顆粒細(xì)胞；S.小型卵泡中顆粒細(xì)胞Fig.7 The FSHR and LHR expression in GCs from three follicles of different diametersL.Large follicles；M.Middle follicles；S.Small follicles

目前，卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)不僅用于生殖生理方面的基礎(chǔ)研究，在生殖病理、毒理等研究方面的作用也日趨重要［7］。因此，研究顆粒細(xì)胞是生殖相關(guān)研究的很好的切入點(diǎn)［8］。由于豬卵巢結(jié)締組織豐富，分離困難，這就使得卵泡的分離獲得成為制約研究的重要步驟之一。之前的研究表明酶消化法對(duì)卵泡基膜會(huì)造成一定程度的破壞而影響卵泡機(jī)能［9］，目前大多數(shù)研究者更傾向于采用機(jī)械分離法來獲得卵泡［10］。本試驗(yàn)采用機(jī)械剖剪法分離獲得了豬不同直徑卵泡中的顆粒細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞得率高，且獲得了較高的成活率及純度，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［11］。顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，呈單層貼壁，集落狀生長。對(duì)不同直徑卵泡獲得的顆粒細(xì)胞進(jìn)行生長曲線測(cè)定，結(jié)果顯示，豬卵巢顆粒細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長期為24～120h，其中48～96h生長最為旺盛。因此我們下一步試驗(yàn)推薦在48～72h間進(jìn)行，如此能使得細(xì)胞在整個(gè)試驗(yàn)過程中處于對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)。Santini等［12］和Tiemann等［13］均在細(xì)胞培養(yǎng)48h時(shí)進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，Nynca等［14］在72h 進(jìn)行試驗(yàn)，這均與我們的結(jié)果相符。同時(shí)，三類顆粒細(xì)胞中，中型卵泡的顆粒細(xì)胞的生長曲線S型更為典型，達(dá)到平臺(tái)期時(shí)所獲細(xì)胞數(shù)量也最多。

FSHR于卵巢顆粒細(xì)胞細(xì)胞膜特異性表達(dá)［6，8，15］，本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量方法檢測(cè)FSHR的表達(dá)以鑒定顆粒細(xì)胞，由于試驗(yàn)中顆粒細(xì)胞均取自于有腔卵泡，可能會(huì)有不同程度的黃體化現(xiàn)象，故同時(shí)檢測(cè)LHR基因的表達(dá)，比較三類顆粒細(xì)胞黃體化程度。根據(jù)實(shí)時(shí)定量結(jié)果，小型卵泡中顆粒細(xì)胞的FSHR的表達(dá)量最高且LHR的表達(dá)量最低即黃體化程度最低，但由于其卵泡直徑很小，剖剪難度大，細(xì)胞純度低，生長曲線情況較其他兩種不理想，在靳雙星等進(jìn)行卵泡培養(yǎng)過程中，部分卵泡死亡，以較小卵泡死亡為主，小卵泡死亡多是變形解體［10］，故不宜成為研究所需的理想類型，大型和中型卵泡所獲得的顆粒細(xì)胞FSHR的表達(dá)量差異性不顯著，但LHR的基因表達(dá)量差異性顯著，大型卵泡中顆粒細(xì)胞黃體化程度顯著高于中型卵泡，且中型卵泡中顆粒細(xì)胞的成活率最高75%，純度95%，生長曲線即細(xì)胞生長狀態(tài)為最優(yōu)。

綜合卵泡獲得難易程度、細(xì)胞得率、顆粒細(xì)胞活率、純度、體外培養(yǎng)生長增殖狀態(tài)、FSHR基因表達(dá)情況及黃體化程度等分析，試驗(yàn)結(jié)果證明，中型卵泡為后續(xù)生殖毒理學(xué)試驗(yàn)研究的最適細(xì)胞來源。

［1］Havelock J C，Rainey W E，Carr B R.Ovarian granulosa cell lines［J］.Molecular and Cellular Endocrinology，2004，228（1－2）：67－78.

［2］Porter M B，Brumsted J R，Sites C K.Effect of prolactin on follicle－stimulating hormone receptor binding and progesterone production in cultured porcine granulosa cells［J］.Fertil Steril，2000，73（1）：99－105.

［3］Basini G，Baioni L，Bussolati S.Prolactin is a potential physiological modulator of swine ovarian follicle function［J］.Regul Pept，2014，189：22－30.

［4］Jackowska M，Kempisty B，Wozna M.Differential expression of GDF9，TGFB1，TGFB2and TGFB3in porcine oocytes isolated from follicles of different size before and after culture in vitro［J］.Acta Vet Hung，2013，61（1）：99－115.

［5］Jiang Z，Price C A.Differential actions of fibroblast growth factors on intracellular pathways and target gene expression in bovine ovarian granulosa cells［J］.Reproduction，2012，144（5）：625－632.

［6］Taru Sharma G，Dubey P K，Sai Kumar G.Localization and Expression of Follicle－Stimulating Hormone Receptor Gene in Buffalo（Bubalus bubalis）Pre－Antral Follicles［J］.Reproduction in Domestic Animals，2011，46（1）：114－120.

［7］張?zhí)鞂?大鼠卵巢細(xì)胞體外培養(yǎng)及生殖毒理研究中的應(yīng)用［J］.衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，1997（2）：60－62.

［8］白曉紅，糜若然，岳天孚，等.體外培養(yǎng)人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞的鑒定及其分泌功能變化［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2005（5）：351－352.

［9］葉 婧，丁 婷，杜小芳，等.不同分離方法對(duì)人卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013（17）：1－5.

［10］靳雙星，張桂枝，李躍民.豬腔前卵泡機(jī)械分離研究［J］.中國畜牧雜志，2006（13）：9－11.

［11］Lovekamp T N，Davis B J.Mono－（2－ethylhexyl）phthalate suppresses aromatase transcript levels and estradiol production in cultured rat granulosa cells［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2001，172（3）：217－224.

［12］Santini S E，Basini G，Bussolati S.The Phytoestrogen Quercetin Impairs Steroidogenesis and Angiogenesis in Swine Granulosa Cells In Vitro［J］.Journal of Biomedicine and Biotechnology，2009，2009：1－8.

［13］Tiemann U，Schneider F，Vanselow J.In vitro exposure of porcine granulosa cells to the phytoestrogens genistein and daidzein：effects on the biosynthesis of reproductive steroid hormones［J］.Reprod Toxicol，2007，24（3－4）：317－325.

［14］Nynca A，Jablonska O，Slomczynska M.Effects of phytoestrogen daidzein and estradiol on steroidogenesis and expression of estrogen receptors in porcine luteinized granulosa cells from large follicles［J］.J Physiol Pharmacol，2009，60（2）：95－105.

［15］Simoni M，Gromoll J，Nieschlag E.The follicle－stimulating hormone receptor：biochemistry，molecular biology，physiology，and pathophysiology［J］.Endocr Rev，1997，18（6）：739－773.