黃文秀，郭慶啟，石彥國，張 娜,*

酪蛋白非磷酸肽對大豆多肽的修飾及復合物的乳化性表征

黃文秀1，郭慶啟2，石彥國1，張 娜1,*

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江省食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

通過Plastein反應利用酪蛋白非磷酸肽（casein non-phosphopeptides，CNPPs）對大豆多肽進行修飾，對制備出的CNPPs-大豆多肽復合物進行電泳、乳化性質和微觀結構分析。結果表明：反應最佳工藝參數為：反應溫度42 ℃、pH 4.8、時間3 h、凝乳酶添加量5 g/100 mL，該最優(yōu)條件下產物的產率為（45.26±0.62）%，電泳結果證實CNPPs和大豆多肽發(fā)生了組合。對復合物功能性評價發(fā)現，CNPPs-大豆多肽復合物乳化性為0.28±0.02，乳化穩(wěn)定性為（13.44±0.47）min，均高于大豆多肽的乳化性和乳化穩(wěn)定性。微觀結構較未修飾的大豆多肽呈現出更多的、均一的球形乳化微粒，證實通過CNPPs對大豆多肽的修飾可以有效提高蛋白質的乳化性和乳化穩(wěn)定性。

酪蛋白非磷肽；大豆多肽；復合物；乳化性；微觀結構

酪蛋白是乳中含量極為豐富的蛋白質，其蛋氨酸（Met）的含量約占總酪蛋白的3.26%，這些Met主要存在于酪蛋白非磷酸肽（casein non-phosphopeptides，CNPPs）部分，每100 g CNPPs含Met約3.1 g[1]。CNPPs是酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）制備過程中的副產物，以疏水性氨基酸為主，隨著CPPs商業(yè)化進程的不斷 加深，大量的CNPPs也就相應生成。CNPPs目前主要作為3 類重要的生物活性肽的原料：免疫調節(jié)肽、抗氧化活性肽、抑制血管緊張素轉化酶活性肽[2]，但這些研究均處于實驗室初級階段，生產過程中有近80%的CNPPs未被合理利用，作為飼料或廢物棄去，如何充分利用CNPPs資源具有很大的經濟效益，也具有一定的社會效益[3-4]。

大豆蛋白作為大豆中含量最為豐富的優(yōu)質植物蛋白質，水解產生的肽類具有抗氧化、抑制ACE、免疫調節(jié)、抗血栓、抗致病菌和促進雙歧桿菌增殖等功能，在國內外食品科學研究和應用領域被廣泛關注。但是，有兩 大方面不足是其發(fā)展的瓶頸。一是從營養(yǎng)學角度看，大豆蛋白的氨基酸組成中含硫氨基酸（主要是Met）含量極低（僅為1.0～1.4 g/100 g），Met在人體內與ATP結合生成S-腺苷蛋氨酸，人體內無法自身生成，一旦缺乏會導致體內蛋白質合成受阻，引起生長減緩，腎臟腫大和肝臟鐵堆積，最后導致肝壞死等一系列機體損害。為了彌補大豆蛋白中Met含量過少的缺陷，很多科研人員在大豆蛋白中添加游離Met，不過，游離Met在加工過程中不穩(wěn)定，容易產生不良氣味，而且容易和食品中的其他成分反應[3]，簡單的添加游離Met的方法是不可行的。二是從應用角度來看，大豆蛋白的乳化性、乳化穩(wěn)定性、溶解性、膠凝性等功能性質欠佳。國內外科學家紛紛對大豆蛋白進行修飾，修飾的方法包括物理方法[5-6]、化學方法[7]和酶法[8-9]，采用酶法對蛋白質進行修飾具有安全、可控等多方面優(yōu)勢[10]，但酶法改性過程有諸多含疏水性氨基酸側鏈的苦味肽伴隨產生，這使得大豆蛋白的功能性缺陷和風味缺陷之間存在此消彼長的關系。因此本課題組考慮利用富含Met的副產物進行再利用，同大豆蛋白的疏水區(qū)域進行溫和融合，二者在酶的作用下形成一種新的類蛋白復合物，從而促使大豆蛋白的營養(yǎng)組成更加完善同時確保其具有良好的功能性質。利用酶將一種物質同大豆蛋白質相結合，在改善蛋白質功能性方面表現出來巨大的潛力，并能提供新的蛋白質資源，已經引起了日本、美國以及歐洲國家的廣泛關注，已成為食品蛋白質領域研究熱點之一[11]。

有科研人員曾經對酪蛋白酸鈉和大豆蛋白之間的結合狀況進行研究[12-14]，結果發(fā)現表面疏水性是影響二者結合的至關重要的因素[12]。因此，研究過程對大豆蛋白水解形成的大豆多肽的表面疏水性進行調控，以期促進其與CNPPs發(fā)生最大化的正向復合。本實驗采用胰凝乳酶催化CNPPs對大豆多肽進行修飾研究，通過測定CNPPs-大豆多肽復合物的乳化性和乳化穩(wěn)定性進行考察，并對復合物的亞基變化和微觀結構進行表征，判斷CNPPs修飾下大豆多肽的乳化特性，為大豆蛋白的酶法改性以及新的優(yōu)質大豆蛋白資源的開發(fā)和CNPPs重新被利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

CNPPs和大豆多肽溶液 本實驗室制得。

Maxiren-180胰凝乳酶（10 000 U/g，食品級） 荷蘭代夫特DSM公司；其他所用試劑均為分析純。

AL204型電子天平、DELTA 320型精密pH計 梅特勒-托利多中國有限公司；722型分光光度計 上海精密

科學儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；FOSS2094型均質機 上海東華儀器有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；電泳儀和電泳槽 北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 CNPPs-大豆多肽復合物的制備

圖1 CNPPs-大豆多肽復合物制備過程示意圖Fig.1 Flowchart for the preparation of CNPP-soybean polypeptide complexes

CNPPs-大豆多肽復合物制備過程如圖1所示。將質量濃度為80 g/100 mL的CNPPs與一定表面疏水性的60 g/100 mL大豆多肽以一定的時間、pH值、溫度、體積比為1∶1，加入一定質量濃度為0.001 g/mL胰凝乳酶溶液，調控形成復合反應體系，充分攪拌，不斷監(jiān)測重組產物的產率和反應體系的透光率，進而判斷CNPPs與大豆多肽的復合效果。

1.2.2 各因素對CNPPs-大豆多肽復合物的影響

1.2.2.1 時間對CNPPs-大豆多肽復合物的影響

固定pH 4.4、溫度42 ℃、加酶量3 g/100 mL，分別在時間為1、2、3、4、5、6 h條件下進行反應，計算CNPPs-大豆多肽復合物的產率和反應體系透光率。

1.2.2.2 pH值對CNPPs-大豆多肽復合物的影響

固定溫度為42 ℃、加酶量3 g/100 mL、時間為5 h， pH值分別為4.0、4.4、4.8、5.2、5.6條件下進行反應，計算CNPPs-大豆多肽復合物的產率和反應體系透光率。

1.2.2.3 溫度對CNPPs-大豆多肽復合物的影響

固定時間5 h、加酶量3 g/100 mL、pH 4.4，溫度分別為34、38、42、46、50 ℃條件下進行反應，計算CNPPs-大豆多肽復合物的產率和反應體系透光率。

1.2.2.4 加酶量CNPPs-大豆多肽復合物的影響

固定時間5 h、溫度42 ℃、pH 4.4，加酶量分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9 g/100 mL進行反應，計算CNPPs-大豆多肽復合物的產率和反應體系透光率。

1.2.3 CNPPs-大豆多肽復合物產率測定

反應結束后取沉淀通過過濾、干燥后稱質量，記錄CNPPs和大豆多肽的干質量，計算CNPPs-大豆多肽復合物的產率。

1.2.4 反應溶液透光率的測定

在反應過程中每小時取反應體系上、中、下不同位置溶液，分別以蒸餾水為空白，在722型分光光度計，波長400 nm處測其透光率。

1.2.5 CNPPs-大豆多肽復合物的特性研究

1.2.5.1 電泳表征

將大豆多肽、CNPPs、反應產物分別分散于含1%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、1%巰基乙醇的磷酸溶液（0.01 mol/L，pH 6.8）中，配制成的樣品中蛋白質質量濃度1 mg/mL。利用12.5%分離膠（含尿素4.7%），5%濃縮膠，陰極緩沖液為含0.1% SDS的Tris-HCl緩沖液（0.074 mol/L，pH 7.4），陽極緩沖液為含0.2% SDS的Tris緩沖液（1 mol/L，pH 7.8），使用前稀釋5 倍。電泳上樣量12 μL，電泳電流為恒定20 mA。電泳結束后在50%甲醇，0.054%甲醛水溶液中固定1 h后，用考馬斯亮藍R250染色1 h后進行脫色，進行電泳分析。

1.2.5.2 功能性測定

采用Surówka等[15]的分光光度法測定產物的乳化性和乳化穩(wěn)定性[16]。

1.2.5.3 透射電鏡表征

將干燥的大豆多肽、CNPPs、CNPPs-大豆多肽、CNPPs-大豆多肽復合物粉末分別用超純水稀釋30 倍，超聲20 min，移取20 μL樣液于潔凈電鏡觀測臺表面，將覆有聚乙烯醇縮甲醛膜的銅網浸入樣品溶液吸附10 min，再用濾紙吸去銅網周邊多余的液體。將pH 6.5的1%磷鎢酸滴于潔凈表面，負染1.5 min后用濾紙吸去多余液體，待樣品晾干后利用透射電子顯微鏡在100 kV的加速電壓下對經磷鎢酸染色的樣品進行觀測。

1.3 統(tǒng)計分析

數據采用SPSS 13.0軟件進行方差分析（analysis of variance，ANOVA），結果以3 次測量的±s表示。

2 結果與分析

2.1 CNPPs-大豆多肽復合物的制備

2.1.1 反應時間對CNPPs-大豆多肽復合物制備的影響

CNPPs-大豆多肽的產量是判斷CNPPs和大豆多肽復合效果的主要判斷依據。本實驗中，在不同因素和水平下分別從反應溶液的上、中、下取樣進行透光率的測定，并分析反應產物的產率，從而尋找出二者之間的關系，為快速判定復合終點提供依據。

圖2 反應時間對CNPPs-大豆多肽復合物的影響Fig.2 Effect of reaction time on CNPP-soybean polypeptide complexes

反應時間對CNPPs-大豆多肽復合物的影響結果如圖2所示，當CNPPs與大豆多肽反應溶液的透光率增加時，CNPPs-大豆多肽復合物產量也不斷增加，說明反應體系中更多的CNPPs與大豆多肽發(fā)生了聚合，使體系溶液更加澄清，復合物產量增加。隨著反應時間的延長，反應體系的透光率先顯著增加然后保持不變；CNPPs-大豆多肽復合物也同樣發(fā)生了先顯著增長、后期變化不顯著的趨勢。根據不同反應時間下溶液的透光率和復合物的產率，選擇復合反應時間為3 h，此條件下反應得到的CNPPs-大豆多肽的產率為42.10%，溶液透光率為8.68±0.20。反應3～5 h內，溶液的透光率和復合物的產率變化均不顯著（P＞0.05），而反應達到6 h時，溶液的透光率又出現顯著下降（P＜0.05），反應6 h時，CNPPs-大豆多肽復合物很可能在胰凝乳酶作用下發(fā)生二次降解，導致溶液的透光率有所降低。

2.1.2 反應pH值對CNPPs-大豆多肽復合物制備的影響

圖3 反應pH值對CNPPs-大豆多肽復合物的影響Fig.3 Effect of reaction pH on CNPP-soybean polypeptide complexes

不同反應pH值對CNPPs-大豆多肽復合物制備的影響結果如圖3所示。反應體系的pH值為4.4時，體系的透光率達到最大值，但當反應體系的pH值為4.8時，CNPPs-大豆多肽組復合物的產率最高，達到40.70%，這種變化規(guī)律與胰凝乳酶的酶學特性以及pH環(huán)境對CNPPs和大豆多肽吸引程度構成很大的影響。由于胰凝乳酶的最適作用pH值是4.2，所以，當反應體系的pH值調整到4.4時，胰凝乳酶作用效果很好，促使溶液中的大豆多肽和CNPPs發(fā)生迅速聚集，使反應體系澄清度增加，透光率增大（P＜0.05），但這個情況下很可能一些迅速聚集起來的CNPPs-大豆多肽復合物過小，沒有形成大的整體，從目前的實驗結果來看，pH 4.8的反應體系下，CNPPs和大豆多肽結合程度要稍好于其他pH環(huán)境。因此，將反應體系的pH值確定為4.8。

2.1.3 反應溫度對CNPPs-大豆多肽制備的影響

圖4 反應溫度對CNPPs-大豆多肽復合物的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on CNPP-soybean polypeptide complexes

不同反應溫度對CNPPs-大豆多肽復合物制備的影響結果如圖4所示。隨著體系溫度的改變，溶液的透光率和復合物均出現先增加后降低的變化趨勢。在體系溫度為42 ℃時，溶液透光率和復合物的產率均出現最大值，溫度超過42 ℃的反應環(huán)境下，當反應3 h時，體系中酶可能存在較大的失活現象，導致結合過程不夠充分。

2.1.4 加酶量對CNPPs-大豆多肽制備的影響

圖5 加酶量對CNPPs-大豆多肽復合物的影響Fig.5 Effect of rennin dosage on CNPP-soybean polypeptide complexes

加酶量對CNPPs-大豆多肽制備的影響結果如圖5所示。加酶量的不斷增加導致體系中透光率和復合物的產率均出現不斷增長的變化趨勢，不過，當酶添加量大于5 g/100 mL時，這種增長逐漸緩慢（P＜0.05），因此考慮采用5 g/100 mL的胰凝乳酶添加量促進CNPPs和大豆多肽的復合正向發(fā)生。

當采用胰凝乳酶添加量5 g/100 mL、反應體系pH 4.8、反應溫度42 ℃、反應3 h時，得到的CNPPs-大豆多肽復合物的產量為（45.26±0.62）%。

2.2 CNPPs-大豆多肽復合物電泳分析

圖6 大豆多肽-CNPPs復合物電泳圖Fig.6 Electrophorsis of CNPP-soybean polypeptide complexes

對CNPPs、大豆多肽以及CNPPs-大豆多肽復合物進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，結果如圖6所示。CNPPs-大豆多肽復合物中分子質量在50.2、37.6、18.8 kD處的條帶主要由大豆多肽提供（泳道1、2），CNPPs在此分子質量范圍內并無條帶生成，而CNPPs在分子質量22.5 kD和16.8 kD處出現兩條顏色較淺的條帶，CNPPs-大豆多肽復合物也恰好在這兩處出現亞基（泳道1、3），CNPPs在分子質量14.4 kD以下的條帶呈連續(xù)分布，這也使得CNPPs-大豆多肽復合物在該分子質量范圍比大豆多肽出現更深的亞基條帶。結果初步表明，CNPPs-大豆多肽復合物極有可能是由CNPPs和大豆多肽共同形成的產物。

2.3 大豆多肽復合物特性的評價

圖7 CNPPs-大豆多肽復合物乳化性能評價Fig.7 Emulsibility and emulsion stability of CNPP-soybean polypeptide complexes

對大豆多肽以及CNPPs-大豆多肽復合物進行乳化性和乳化穩(wěn)定性進行評價，結果如圖7所示。利用Plastein反應所得到的CNPPs-大豆多肽復合物的乳化性和乳化穩(wěn)定性分別為0.28±0.02和（13.44±0.47）min，比本研究中未經CNPPs修飾大豆多肽的乳化性和乳化穩(wěn)定性極其顯著地分別提高了90%和37%（P＜0.000 1）。同其他研究者對于大豆蛋白的乳化性能方面的研究比較發(fā)現，殷軍等[17]利用脫脂豆粕醇洗，晾干制作的大豆?jié)饪s蛋白的乳化性約為0.01、乳化穩(wěn)定性為10.50 min；物理改性得到的大豆?jié)饪s蛋白的乳化性約為0.14、乳化穩(wěn)定性為11 min；采用堿溶酸沉法制備得到的大豆分離蛋白的乳化性約為0.06，乳化穩(wěn)定性約為15 min。顧振宇等[18]使用用醇洗大豆?jié)饪s蛋白經物理改性，噴霧干燥制得改性大豆?jié)饪s蛋白的乳化性0.135、乳化穩(wěn)定性為11.68 min。CNPPs-大豆多肽復合物的乳化性和乳化穩(wěn)定性比一些研究結果稍有提高。

2.4 透射電鏡技術對CNPPs-大豆多肽復合物的表征

圖8 大豆多肽（a）、CNPPs（b）、CNPPs-大豆多肽復合物（c）的透射電鏡結果（×100 000）Fig.8 Transmission electron microscopic profiles of soybean peptide (a), CNPPs (b) and CNPP-soybean peptide complexes (c) (× 100 000)

用透射電鏡觀察大豆多肽、CNPPs、CNPPs-大豆多肽復合物顆粒的表面，如圖8所示。由圖8a可知，大豆多肽微觀結構相對致密，可見大小不等的圓形及不規(guī)則形塌陷，這與大豆多肽熱處理過程可能存在一定的關系。圖8b顯示，CNPPs微觀結構呈現疏松，無規(guī)則狀態(tài)，結構中存在明顯的不規(guī)則孔隙。而圖8c中所呈現的CNPPs-大豆多肽復合物的微觀結構與大豆多肽和CNPPs有相似之處，CNPPs-大豆多肽復合物結構中既存在大面積不規(guī)則塌陷，又存在無規(guī)則孔隙，這也進一步證實了SDS-PAGE的結論，即CNPPs-大豆多肽復合物是CNPPs和大豆多肽結合所形成的共同體。同時，CNPPs-大豆多肽復合物的微觀結構與大豆多肽和CNPPs之間存在顯著的不同，CNPPs-大豆多肽復合物微觀結構表面存在直徑為40～60 nm的球形結構，該微球尺寸顯著小于目前其他研究者對于大豆蛋白乳化微球的研究結果[8,19-20]，這可能與電鏡分析前處理過程中所使用的化學試劑存在一定關系。不過，從圖8a、c比較來看，CNPPs-大豆多肽復合物溶解后所形成的的乳化微粒顯著多于大豆多肽，也間接證明CNPPs對大豆多肽修飾后產物的乳化性和乳化穩(wěn)定性有所提高。

3 結 論

對CNPPs-大豆多肽復合物制備工藝參數進行單因素試驗，優(yōu)化后的最優(yōu)工藝參數為：時間為3 h、pH值為4.8、溫度為42 ℃、加酶量為5 g/100 mL。按此工藝參數進行驗證實驗，CNPPs-大豆多肽復合物的產率高達（45.26±0.62）%。對CNPPs-大豆多肽復合物的乳化特性評價，乳化性為0.28±0.02，乳化穩(wěn)定性為（13.44±0.47）min，優(yōu)于未經CNPPs修飾的大豆蛋白。SDS-PAGE和透射電鏡均顯示，CNPPs-大豆多肽復合物較大豆多肽在結構上發(fā)生了改變，有新的亞基生成，這是大豆多肽和CNPPs在一系列物理化學變化下發(fā)生組合的結果。

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Soybean Polypeptide Modification by Casein Non-phosphopeptides (CNPPs) and Emulsification Properties of the Resulting Complexes

HUANG Wen-xiu1, GUO Qing-qi2, SHI Yan-guo1, ZHANG Na1,*
(1. Key Laboratory of Food Science and Engineering of Heilongjiang Province, College of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

Casein nonphosphopeptides were used to modify soybean polypeptide by plastein reaction. The resulting CNPP-soybean polypeptide complexes were studied by SDS-PAGE and their emulsifying properties and microstructure were investigated. The optimum reaction conditions were found to be reaction at 42 ℃ and pH 4.8 for 3 h with added rennin at 5 g/100 mL, resulting in a yield of products of (45.26±0.62)%. SDS-PAGE demonstrated that CNPPs bound to soybean polypeptide. The functionality evaluation of CNPP-soybean polypeptide complexes showed the emulsibility and emulsion stability to be 0.28±0.02 and (13.44±0.47) min, respectively, both of which were higher than those of soybean polypeptide. The miscrostructure showed a larger number of homogeneous spherical microemulsion particles than that of unmodified soybean polypeptide, illustrating that the modification of soybean polypeptides by CNPPs can increase the protein emulsibility and emulsiion stablity effectively.

casein nonphosphopeptides (CNPPs); soybean polypeptides; complex; emulsifying characteristics; microstructure

TS201.2

A

1002-6630（2014）09-0157-05

10.7506/spkx1002-6630-201409032

2013-06-27

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301602）；“十二五”農村領域國家科技計劃項目（2012BAD34B04）；黑龍江省應用技術研究與開發(fā)計劃項目（2013G0558）；黑龍江省高校科技創(chuàng)新團隊建設計劃項目（2010td11）

黃文秀（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：1129635023@qq.com

*通信作者：張娜（1979—），女，副教授，博士，研究方向為食品化學與食品安全。E-mail：foodzhangna@163.com