蒿洪欣，許園園，劉 冬，韓新寬，牛天琦，郭玉輝，祈詩月，楊清香,2,*

降解類胡蘿卜素產(chǎn)香細菌的篩選及鑒定

蒿洪欣1，許園園1，劉 冬1，韓新寬1，牛天琦1，郭玉輝1，祈詩月1，楊清香1,2,*

（1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.河南師范大學(xué) 資源微生物與功能分子河南省高校重點實驗室， 河南 新鄉(xiāng) 453007）

本實驗從常年落花的土壤中分離 到了6株能降解類胡蘿卜素并且產(chǎn)生香味的菌株。形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA序列分析表明，其中有3株與Bacillus subtills和Bacillus tequilensis聚在一起，2株與Bacillus methylotrophicus和Bacillus pum ilus相似性最高，1株菌與Bacillus licheniformis親緣關(guān)系最 近。通過透明圈觀察和OD495nm判定培養(yǎng)基中的類胡蘿卜素明顯被降解，并且通過氣相色譜-質(zhì)譜法初步分析了其降解產(chǎn)物，產(chǎn)物中主要為2-庚酮、棕櫚酸、鄰苯二甲酸酐等物質(zhì)。

類胡蘿卜素；芽孢桿菌；篩選；透明圈

類胡蘿卜素（carotenoids）是一組具有抗氧化性的脂溶性色素的總稱，廣泛存在于動物、植物和一些微生物中[1]。通常由8個類異戊二烯單元組成，主要指胡蘿卜素和葉黃素這兩大類天然色素[2]，類胡蘿卜素性質(zhì)不穩(wěn)定，易降解，降解方式有高溫氧化降解、熱裂解、化學(xué)氧化降解、光氧化降解、生物氧化及酶催化氧化降解等[3]，其降解產(chǎn)物主要為二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-紫羅蘭酮等致香物質(zhì)，是重要的香料前體化合物[4]。類胡蘿卜素的生物氧化降解反應(yīng)，或者酶催化氧化降解反應(yīng)是重要的香氣物質(zhì)生成途徑[5]。類胡蘿卜素的生物降解因其條件溫和、效率高而越來越受到關(guān)注。Zorn等[6]從含有萜烯類物質(zhì)較多的基質(zhì)中分離到50多株具有將β-胡蘿卜素降解為香味物質(zhì)能力的絲狀真菌和酵母菌，這50株菌能轉(zhuǎn)化或合成萜烯類化合物，產(chǎn)生的香味物質(zhì)主要為二氫獼猴桃內(nèi)酯和β-紫羅蘭酮；李秀紅等[7]從胡蘿卜中分離到了1株能降解胡蘿卜素產(chǎn)香的真菌，產(chǎn)生的二氫獼猴桃內(nèi)酯可賦予卷煙煙氣清甜、木香和涼香，柔和煙氣，為煙草中重要的致香物質(zhì)，為二氫獼猴桃內(nèi)酯的合成提供了一條新的途徑；Dionísio等[8]從富含β-胡蘿卜素的水果中篩選出能降解β-胡蘿卜素的菌株，為香味物質(zhì)β-紫羅蘭酮的獲得提供了一條廉價、高效的途徑。然而目前類胡蘿卜素的微生物降解產(chǎn)香還都在實驗探究階段，并未有大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用，而且利用細菌降解產(chǎn)香的報道也較少，本實驗試圖從常年落花的土壤中篩選出能夠降解類胡蘿卜素產(chǎn)香的細菌，利用細菌的易培養(yǎng)、繁殖快、生長周期短的特點為香味物質(zhì)的獲得提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

參照土樣采集標準方法[9]，采集河南師范大學(xué)校園內(nèi)常年落花的土壤。采樣時先除去表層5 cm表土，取5～10 cm深的土壤為樣品。

1.2 試劑與儀器

蛋白胨、瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；正己烷（色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；類胡蘿卜素（10%） 湖北鴻運隆生物科技有限公司。

UV1800紫外-可見分光光度計、HP5890-5972氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS） 日本島津公司。

1.3 培養(yǎng)基

細菌用分離培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、類胡蘿卜素5 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.2。類胡蘿卜素在其他培養(yǎng)基成分121 ℃、20 min滅菌并冷卻至60 ℃左右時加入，然后倒平板待用。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、類胡蘿卜素5 g/L，pH 7.0～7.2。類胡蘿卜素在其他培養(yǎng)基成分121 ℃、20 min滅菌并冷卻至60 ℃左右時加入。

1.4 方法

1.4.1 菌株初篩

將所取土樣稱取3 g溶于300 mL無菌水中，同時加入無菌的玻璃球振蕩培養(yǎng)4 h得到菌懸液，將菌懸液梯度稀釋后涂布分離培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。挑取能夠在分離培養(yǎng)基上生長產(chǎn)生明顯透明圈并且打開皿蓋有香味產(chǎn)生的菌株，進行進一步劃線純化和復(fù)篩。

1.4.2 菌株復(fù)篩

將初篩菌株接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h作為種子液，然后以10%的接種量接種到相應(yīng)的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量100 mL/250 mL錐形瓶，之后37 ℃、170 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)60 h。由于類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度和OD495nm值之間存在正相關(guān)關(guān)系[10]，所以在接種前后測定液體培養(yǎng)液的OD495nm值，通過OD495nm值的變化情況來進一步確定該菌株能不能降解類胡蘿卜素。以沒加類胡蘿卜素但其他成分均相同的培養(yǎng)液作為對照，每隔12 h測量培養(yǎng)液的OD495nm值，每個菌株做3 個平行，最后取平均值，選取OD495nm值明顯下降的菌株進行分析。

1.4.3 胡蘿卜汁的降解

胡蘿卜汁的制備：將新鮮的胡蘿卜洗凈磨碎，稱取20.00 g磨碎的胡蘿卜泥，用無菌水稀釋至100 mL待用。

將復(fù)篩所得菌的種子液按10%的接種量接種到胡蘿卜汁中，裝液量為100 mL/250 mL錐形瓶，37 ℃、170 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)60 h，分別在接種前后每隔12 h測OD495nm值的變化情況。

1.4.4 發(fā)酵液降解產(chǎn)物的鑒定

1.4.4.1 降解產(chǎn)物的抽提

根據(jù)參考文獻[11]中的提取方法，取100 mL培養(yǎng)60 h的發(fā)酵液和2 mL的正己烷放入100 mL的分液漏斗中，反復(fù)顛倒使降解產(chǎn)物充分融入有機相，取有機相經(jīng)0.45 μm濾膜過濾上樣，由GC-MS鑒定結(jié)果和NIST庫檢索定性，以未加菌的培養(yǎng)液作為對照。

1.4.4.2 GC-MS分析條件[12]

GC條件：色譜柱為HP-5（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：氦氣；進樣口溫度：260 ℃，接口溫度：250 ℃；載氣流量：1 mL/min；程序升溫：初溫50 ℃，恒溫2 min后，以4 ℃/min的速率升至230 ℃，保持20 min；進樣量：1 μL；分流比：10∶1；溶劑延遲：5 min。

MS條件：EI電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；電子倍增器電壓：1 200 V；質(zhì)量掃描范圍：30～550 u；MS譜庫NIST02檢索定性。

1.4.5 發(fā)酵瓶中氣相產(chǎn)物的分析

本實驗在發(fā)酵過程中能明顯聞到有香味的產(chǎn)生，因此對發(fā)酵了60 h所產(chǎn)生的氣體進行收集并10 倍壓縮，將壓縮氣體進行手動注射器上樣分析。

GC條件：參照參考文獻[12]中的GC條件略加改動，色譜柱為HP-5（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：初始溫度30 ℃，保持6 min，以每分鐘10 ℃的速率升溫至260 ℃，保持40 min；載氣：氮氣；進樣口溫度：290 ℃；分流比：5∶l；進樣量：0.5 μL；流速：0.5 mL/min。

1.4.6 菌株的鑒定

菌株的最終鑒定采用形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析的方法。按照常規(guī)方法觀察菌體在上述分離平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，菌體的顯微形態(tài)特征研究采用革蘭氏染色和顯微鏡觀察的方法。

細菌核基因組DNA的提取采用液氮研磨和CTAB抽提法提取[13]，以所提取的DNA為模板，進行16S rDNA擴增[14]，所用引物為細菌通用引物27F（正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（反向引物：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3）。聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增反應(yīng)體系為：12.5 μL Master mix、9.9 μL ddH2O、0.8 μL的引物（稀釋10 倍）、1 μL DNA模板。PCR擴增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min、52 ℃復(fù)性1 min、72 ℃延伸80 s、30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。5 μL PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（90 V、30 min），用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。將PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

將菌株的16S rDNA序列在GenBank中進行BLAST比對，選出相似性大于98%的部分序列，以16S rDNA同源性為基礎(chǔ)MEGA4.1軟件進行系統(tǒng)進化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 類胡蘿卜素降解菌的篩選

從優(yōu)化的細菌分離培養(yǎng)基上篩選出6株具有明顯降解透明圈，且在培養(yǎng)過程中有明顯香味產(chǎn)生的菌株，如圖1所示。

圖1 所篩選菌株在類胡蘿卜素培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)和降解透明圈Fig.1 Colony morphology and transparent circles produced by screened strains on carotenoid agar plates

A. 18號菌反面；B. 18號菌正面；C. 21號菌反面；D. 13號菌反面。

表1 各菌株降解類胡蘿卜素過程中發(fā)酵液OD495nm的變化Table 1 Change in OD495nmof fermentation broth during the degradation process of carotenoids by each bacterial strain

表2 各菌株降解胡蘿卜汁的過程中發(fā)酵液OD495nm的變化Table 2 Change in OD495nmof fermentation broth during the degradation process of carrot juice by each bacterial strain

將初篩得到的菌株進行分離純化得到的單菌株接種到相應(yīng)的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照材料和方法所述，測定培養(yǎng)液光密度的變化，OD495nm有明顯降低的菌株即為類胡蘿卜素降解菌，共獲得6 株降解菌。其結(jié)果如表1所示。將各菌株接種到胡蘿卜汁液中，以未加菌株的搖瓶作為對照，測得的OD495nm值的變化如表2所示。OD495nm值的變化可知，所篩6株菌在胡蘿卜汁中的OD495nm值均有下降，說明各菌株也能降解胡蘿卜中的類胡蘿卜素。由表1、2可知，其中18號菌在培養(yǎng)60 h時在培養(yǎng)基和胡蘿卜汁中的OD495nm值分別降低了99.4%和74.7%；其次是13和21號菌株，在培養(yǎng)60 h時，兩菌株在培養(yǎng)基中的OD495nm值分別降低了78.5%和60%，在胡蘿卜汁中的OD495nm值分別降低了72.8%和65.5%，由此可知，18號菌株的降解能力較其他菌株高，且接種前后的胡蘿卜汁的顏色明顯變淺且變透亮，可知接種后胡蘿卜汁中的色素被降解，如圖2所示。

圖2 18號菌在胡蘿卜汁中培養(yǎng)60 h后引起的顏色變化Fig.2 Color change in carrot juice degraded by strain 18 after 60 h cultivation

2.2 菌種鑒定篩選得到的6株菌分別進行菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色[15]和菌體形態(tài)觀察，并進行16S rDNA序列分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，進行鑒定。其在分離培養(yǎng)基平板上的菌落和顯微鏡觀察的菌體形態(tài)特征如表3所示。部分菌株的革蘭氏染色結(jié)果見圖3。這6株菌均為革蘭氏染色陽性，有芽孢的桿狀或短桿狀細菌，初步判斷為芽孢桿菌屬細菌。

表3 所分離菌株的菌落和菌體形態(tài)特征Table 3 Characteristics of colonies and cell morphology of isolated strains

圖3 部分菌株革蘭氏染色和顯微形態(tài)Fig.3 Micrographic observation of exampled strains by Gram staining

以提取出的DNA為模板，按照材料和方法所述進行PCR擴增并測序，由測序結(jié)果知各菌株的16S rDNA序列全長在1 450 bp左右。將該16S rDNA序列遞交NCBI進行BLAST同源序列檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在親緣關(guān)系相近的序列中，各菌株與芽孢桿菌均有98%以上的序列相似性，這與形態(tài)觀察的結(jié)果一致。通過系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建可知（圖4），10、18、21號菌與Bacillus subtilis和Bacillus tequilensis聚在一起，12號菌株與Bacillus licheniformis聚在一起，13號菌與Bacillus methylotrophicus親緣關(guān)系較近，20號菌與Bacillus pumilus聚在一起。

圖4 根據(jù)16S rDNA全長序列構(gòu)建的6株類胡蘿卜素降解菌的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the 6 strains degrading carotenoids established based on the full-length 16S rDNA sequences

2.3 類胡蘿卜素降解產(chǎn)物分析

對18號菌發(fā)酵60 h的發(fā)酵液中主要成分進行分析，結(jié)果如圖5所示。

圖5 培養(yǎng)60 h發(fā)酵液中揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.5 Total ion current chromatogram of volatile components in fermentation broth after 60 h cultivation

對比圖5中的A、B可以發(fā)現(xiàn)，18號菌株降解類胡蘿卜素得到兩個主要峰，經(jīng)過質(zhì)譜分析，其中峰①可能為3-甲基環(huán)戊酮，峰②可能為2-庚酮，該物質(zhì)具有水果梨的香味。在其他菌株中還檢測出來有棕櫚酸和2,5-辛二酮以及鄰苯二甲酸酐等物質(zhì)。

圖6 培養(yǎng)60 h發(fā)酵瓶中氣相部分揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.6 Total ion current chromatogram of volatile components in part of gas in the fermentation flask

收集并壓縮發(fā)酵瓶中的氣相成分進行GC上樣分析，結(jié)果如圖6所示。18號菌的發(fā)酵瓶中的氣體成分比未加菌的氣體成分復(fù)雜。且加菌發(fā)酵液能明顯聞到有香味產(chǎn)生，但是在對發(fā)酵液萃取進行GC-MS分析時并未檢測到β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯等典型的香味物質(zhì)，只檢測出來具有水果梨香味的2-庚酮，目前，發(fā)酵條件、萃取條件和GC-MS分析條件正在摸索，以期得到更有意義的實驗結(jié)果。

3 討 論

本實驗篩選并獲得了6株能夠降解類胡蘿卜素的細菌，通過形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定，均為芽孢桿菌屬的菌株，分屬于4個種：Bacillus subtills、Bacillus licheniformis、Bacillus tequilensis和Bacillus methylotrophicus。有關(guān)芽孢桿菌降解類胡蘿卜素產(chǎn)生香味物質(zhì)的報道沒有見到，Sanchez-Contreras等[16]的報道中，Bacillus sp.只有與Eotrichum sp.混合發(fā)酵才能將葉黃素降解產(chǎn)生β-紫羅蘭酮、7,8-二氫-β-紫羅蘭醇、7,8-二氫-β-紫羅蘭酮、3-氫-β-紫羅蘭酮等致香產(chǎn)物。其他有關(guān)降解類胡蘿卜素產(chǎn)生香味物質(zhì)的報道多是真菌和酵母菌，如Pastore等[17]在木瓜中分離到了1株Geotrichum sp.能產(chǎn)香，Zorn等[6]和李秀紅等[7]均是分離到的真菌和酵母菌能降解類胡蘿卜素產(chǎn)香。而本實驗得的幾種芽孢桿菌都可以單獨發(fā)酵降解類胡蘿卜素產(chǎn)生明顯的香味，但是在這些菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中沒有檢測到如Sanchez-Contreras和Zorn報道的典型香味物質(zhì)，僅檢測到了具有水果香味的2-庚酮。由于發(fā)酵過程中明顯能聞到強烈的香味，因此我們試圖通過GC檢測發(fā)酵瓶中的氣相成分來檢測香味物質(zhì)，雖然氣相中得到了幾個明顯的峰，但由于含量太低而沒能最終鑒定這些峰的分子和性質(zhì)。有關(guān)發(fā)酵液中香味物質(zhì)的檢測方法本課題組還在摸索。

值得關(guān)注的是本實驗中所篩選的菌株對胡蘿卜汁也有明顯的降解作用，并且能夠產(chǎn)生香味，這就為進一步研究提供了新的思路，可以利用這些菌株發(fā)酵蔬菜、飼料或者煙葉，改變飼料的可口性或者改善煙葉的品質(zhì)。

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Screening and Identification of Bacteria Th at Can Produce Flavor Compounds by Degrading Carotenoids

HAO Hong-xin1, XU Yuan-yuan1, LIU Dong1, HAN Xin-kuan1, NIU Tian-qi1, GUO Yu-hui1, QI Shi-yue1, YANG Qing-xiang1,2,*
(1. College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China; 2. Key Laboratory for Microorganisms and Functional Molecules, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China)

Six strains were screened and isolated for their ability to degrade carotenoids and produce flavor compounds from the soil on which perennial flowering plants are grown. Morphological observation and 16S rDNA sequence analysis showed that three of the six strains were clustered with Bacillus subtills and Bacillus tequilensis, two of them had a higher similarity with Bac illus methylotrophicus and Bacillus pumilus, and one had the closest genetic relationship with Bacillus lichniformis. Degradation of carotenoid was determined by observing the transparent circles in carotenoid agar plates and detecting the optical density (OD) at 495 nm. The degradation products were determined preliminarily by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The identified major products were 2-heptanone, palmitic acid, phthalic anhydride and othe r substances.

carotenoids; Bacillus sp.; screening; transparent circle

Q939.99

A

1002-6630（2014）09-0152-05

10.7506/spkx1002-6630-201409031

2013-08-04

國家自然科學(xué)基金面上項目（21077032；21277041）；河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃項目（13IRTSTHN009）

蒿洪欣（1985—），女，碩士研究生，研究方向為環(huán)境微生物。E-mail：1578906909@qq.com

*通信作者：楊清香（1966—），女，教授，博士，研究方向為環(huán)境微生物。E-mail：yangqx66@163.com