胡 盈，趙曉妮，孫鳳陽，劉弈佳，陶 雷，盧 宏，由香玲

(東北林業(yè)大學 a.生命科學學院；b.園林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

刺五加Eleutherococcus senticosusMaxim.為五加科五加屬落葉灌木，別名刺拐棒、刺老芽等。具有抗疲勞、抗衰老，提高免疫力，保護心血管等作用，是十分珍貴的藥物資源。關于其藥用成分的研究已有很多報道[1-2]。近年來，由于刺五加野生資源匱乏，加之其有性繁殖周期較長，自然

在通過質壁處理刺五加合子胚誘導體細胞胚的發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)：胼胝質(主要成分為β-1,3-葡聚糖)與體細胞胚發(fā)生呈現(xiàn)一定的相關性[19-21]。而體細胞胚發(fā)生也是植物體適應外界脅迫因子產(chǎn)生的一種響應。目前還未見普遍存在于高等植物細胞內的2類防御因子——β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶[22]在刺五加體細胞胚發(fā)生過程中的變化規(guī)律的相關報道，這正是本文要探討的問題，旨在為刺五加體細胞胚的發(fā)生機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 刺五加體細胞胚發(fā)生及取材

在前期試驗中獲得了刺五加胚性愈傷組織，掌握了體細胞胚發(fā)生發(fā)育過程[17]。本試驗是在前期研究的基礎上進行的。首先將胚性愈傷組織(見圖1A)在增殖培養(yǎng)基(MS＋1.0mg/L 2,4-D)培養(yǎng)，每20d繼代1次，進行快速增殖。然后接種到不添加任何激素的MS固體培養(yǎng)基上誘導體細胞胚發(fā)生、發(fā)育。從培養(yǎng)2周開始，形成球形體細胞胚(見圖1B)后，依次經(jīng)歷心型、魚雷、到第5周發(fā)育為成熟的子葉體細胞胚(見圖1C)。

圖1 刺五加體細胞胚發(fā)生過程Fig.1 Generating process of somatic embryogenesis in Eleutherococcus senticosus

取增殖培養(yǎng)4周后的胚性愈傷組織，設為對照，接種于未添加任何激素的3％蔗糖MS培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)，每7d取1次樣，每次取8瓶，并將材料按0.3、0.1g分別稱4份，用液氮冷凍保存于-80℃的冰柜中，分別用于測定幾丁質酶活性和胼胝質含量。另取4份各0.5g材料，立刻進行β-1,3-葡聚糖酶的提取，后凍藏保存，用于分析其酶活性。連續(xù)取樣35d。

1.2 幾丁質酶活性的測定

1.2.1 幾丁質粗酶液的提取

取冷凍保存的材料(0.3g)放入預冷的研缽中，加液氮迅速研磨成粉末后，加2.0mL醋酸提取液(0.05 mol/L，pH 5.0)和少量的石英砂，轉入2mL離心管，迅速于4℃下12 000r/min離心15min，上清液轉移到新的1.5mL離心管中，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 N-乙酰葡萄糖胺標準曲線的制備

首先配制100μg/mL N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)母液。分別取9支5mL試管編號1～9號。將配制的質量濃度為 0.0、12.5、25.0、37.5、50.0、62.5、75.0、87.5、100.0μg/mL的N-乙酰葡萄糖胺分別轉入有編號的試管，然后分別加入0.2mL飽和硼砂溶液，沸水浴7min，迅速冷卻后，加2mL冰醋酸、1mL 1％ DMAB，37℃水浴保溫15min后，溶液呈紅色，于585nm波長處，從低質量濃度到高質量濃度測定上述反應液的吸光值，試驗重復3次。取其均值制作標準曲線為：y＝0.008 2x-0.015 9(R2＝0.998 8)。

1.2.3 外切幾丁質酶活性的測定

主要參考Reissig等的方法[23]對外切幾丁質酶活性進行測定。依次取0.4mL粗酶提取液、0.4mL醋酸緩沖液(0.05 mol/L，pH 5.0)和0.4mL膠體幾丁質溶液(1％)于試管中。37℃水浴反應2h后，4 000r/min離心10min。取0.4mL上清液，加0.2mL飽和硼砂溶液(上清液即刻變黃色)，沸水浴7min，冷卻后再加2mL冰醋酸和1mL 1％對二甲氨基苯甲醛溶液，立刻于37℃水浴保溫15min后，溶液呈紅色，于585nm波長處測定溶液吸光值，試驗重復3次。根據(jù)上述建立的標準曲線，計算酶活性。

1.2.4 內切幾丁質酶活性的測定

取0.4mL上述上清液，加40μL 1％蝸牛酶溶液，繼續(xù)在37℃反應30min，用上述Reissig等的方法[23]測定產(chǎn)生的N-乙酰葡萄糖胺量，即得總幾丁質酶活性。總幾丁質酶活性減去外切幾丁質酶活性，即為內切幾丁質酶活性。1個酶活性單位(U)定義為每克鮮植物組織每小時分解膠體幾丁質產(chǎn)生1.0μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量。

1.3 β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性的測定

1.3.1 β-1,3-葡聚糖含量的測定

取冷凍保存的材料(0.1g)，用液氮快速研磨成粉末后，用1.0mL 20％乙醇沖洗3次，10 000r/min離心5min，棄上清，除去材料上的熒光。在樣品中加入1.0mL 1.0 mol/L NaOH，80℃水浴15min，以增加胼胝質的溶解，再10 000r/min離心15min之后，取上清液0.2mL依次加入0.4mL 0.1％苯胺藍、0.21mL 1 mol/L HCl、0.59mL 1 mol/L甘氨酸–氫氧化鈉(Gly-NaOH)緩沖液，振蕩器上振蕩混勻，50℃水浴20min，室溫30min直至苯胺藍變?yōu)闊o色?？瞻讓φ沼?.4mL蒸餾水代替苯胺藍，最后用熒光分光光度計測含量(激發(fā)光400nm和發(fā)射光510nm、激發(fā)狹縫5nm、發(fā)射狹縫5nm、平均時間0.100 00s)。

以茯苓聚糖(Fluki，Buchs,Switzerlands)作對照品，試驗重復3次，取平均值用外標標準曲線法定量，回歸方程為y＝0.366 4x-0.724 9(R2＝0.995 1)，標準曲線在2～10μg之間為線性。

1.3.2 β-1,3-葡聚糖酶活性的測定

β-1,3-葡聚糖酶的提取和活性測定參照史益敏的方法[25]。稱取鮮質量0.5g材料，放入預冷的研缽中，加3.0mL 0.05 mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)和0.05g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，在冰浴中充分研磨，4℃的環(huán)境下15 000×g離心15min，取上清液在10 000×g下離心10min，所得上清液即為粗酶液，放于冰箱備用。取1.0mg/mL的昆布多糖，溶于0.4mL上述醋酸鈉緩沖液，加入0.1mL酶液，于37℃保溫15min，立即加入0.5mL銅試劑，混勻，并于100℃水浴10min，置冷水中冷卻，再加入0.5mL砷鉬酸試劑，呈現(xiàn)藍色后加蒸餾水3.5mL，搖勻，660nm波長的光下比色，對照標準曲線求出樣品液的還原糖含量。以1.0 nmol/(g·s)為1個酶活性單位(U)。

2 結果與分析

2.1 體細胞胚發(fā)生過程中幾丁質酶活性的變化

幾丁質是絕大多數(shù)真菌細胞壁的主要成分，植物中不存在；但幾丁質酶廣泛存在于自然界，在高等植物中也較為普遍。各種植物、動物及微生物細胞和組織中的幾丁質酶可將幾丁質水解為寡聚糖，再進一步水解為N-酰氨基葡萄糖[25]。按照Yeboah等的建議，根據(jù)水解幾丁質切口位置的不同，將幾丁質酶分為內切幾丁質酶和外切幾丁質酶；根據(jù)酸堿性，分為酸性幾丁質酶和堿性幾丁質酶[26]。

在體細胞胚發(fā)生過程中，幾丁質酶活性的變化如圖2所示。由圖2可見，外切和內切幾丁質酶活性在體細胞胚發(fā)生過程中均有顯著變化。從圖2中可以看出，0～14天期間，即球形胚形成時期，活性逐漸增大，到第14天時，外切幾丁質酶活性達到了最大值94.45μg·g-1h-1，是胚性愈傷組織時期的1.61倍；在體細胞胚發(fā)育過程中，隨著培養(yǎng)時間的增加，外切幾丁質酶活性呈下降趨勢，但均顯著高于對照；到第35天時，即子葉胚時期，外切幾丁質酶活性達到最低，顯著低于體胚發(fā)育的其它時期(P＜0.05)。

從圖2中可以看出，在體細胞胚發(fā)生過程中，內切幾丁質酶活性均高于胚性愈傷組織；整體呈上升趨勢，到第35天，即在子葉胚期內切幾丁質酶活性達到最高，為101.15μg·g-1h-1，是對照的3.76倍(P＜0.05)。

從胚性愈傷組織到成熟子葉期體胚，2種幾丁質酶活性的變化規(guī)律完全不同。外切幾丁質酶從胚性細胞到球形期，有顯著的變化，其在體細胞胚發(fā)育過程中起重要的調控作用。類似的在胡蘿卜溫度敏感型細胞變異系ts11中，如果加入一種來自野生型胡蘿卜細胞系的32 kDa酸性幾丁質酶后，該變異系ts11能在非適宜溫度下越過球形胚繼續(xù)發(fā)育，如果不加這種幾丁質酶，細胞系變異系ts11在非適宜溫度下則無法越過球形胚時期[27]。這種32 kDa酸性幾丁質酶在鴨茅體細胞胚發(fā)育的全過程中均被檢測到[26]。刺五加體細胞胚發(fā)育過程中，外切幾丁質酶的特性、作用還需進一步研究。

上述結果中內切幾丁質酶的這種持續(xù)增長的變化趨勢，可能與體細胞胚生長發(fā)育過程中外植體持續(xù)生長、需持續(xù)克服外界的各種光照、溫度等培養(yǎng)環(huán)境的脅迫引起。其確切原因需要進一步研究。

圖2 體細胞胚發(fā)生過程中幾丁質酶活性的變化Fig.2 Changes of chitinase activities during somatic embryogenesis

2.2 體細胞胚發(fā)生過程中β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性的變化

從胚性愈傷組織到成熟子葉胚時期，β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性變化如圖3所示。由圖3可見，在體細胞胚發(fā)生過程中，第0～14天，即球形體胚形成過程中，β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性均呈上升趨勢，在第14天達到最高，β-1,3-葡聚糖含量為61.43μg·g-1，是胚性愈傷組織中含量(21.89μg·g-1)的2.81倍；β-1,3-葡聚糖酶活性為40.23 U·g-1，是胚性愈傷組織中酶活性(15.92 U·g-1)的2.53倍；而后，在第28天和第35天，即體胚發(fā)育成熟時期，β-1,3-葡聚含量及其酶活性急速下降；β-1,3-葡聚含量與胚性愈傷組織的差異不顯著(見圖3)，但酶活性顯著低于胚性愈傷組織(見圖3)(P＜0.05)。

圖3 體胚發(fā)生過程中β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性的變化Fig.3 Changes of the β-1,3-glucan content and β-1,3-glucanase activity during somatic embryogenesis

β-1,3-葡聚糖含量變化與其酶活性的變化較一致，只是在體細胞胚成熟期存在差異。在球形胚時期，β-1,3-葡聚糖含量與其酶活性均較高。在前期研究刺五加直接體細胞胚發(fā)生過程中，發(fā)現(xiàn)胼胝質含量在整個體細胞胚誘導過程中發(fā)生了規(guī)律性變化，認為胼胝質即葡聚糖的大量合成是刺五加體細胞胚發(fā)生的必要條件[21]。在其它植物的體胚誘導過程中，也發(fā)現(xiàn)過類似的β-1,3-葡聚糖含量升高的現(xiàn)象。例如，在誘導菊苣體細胞胚過程中，研究者發(fā)現(xiàn)，葉片為外植體，培養(yǎng)6d時，一些表皮細胞和小表皮細胞的內壁周圍出現(xiàn)了大量的胼胝質，并且一直持續(xù)到大約150μm的原胚細胞團形成時才消失[29]。還有，山茶12周葉齡的葉片為外植體誘導體細胞胚時，在培養(yǎng)3～10d時發(fā)現(xiàn)有胼胝質形成[30]。椰子的體胚誘導過程中產(chǎn)生了胼胝質的沉積[31]，即大量β-1,3-葡聚糖大量合成。研究者普遍認為這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因是β-1,3-葡聚糖產(chǎn)生生理隔離，阻斷了細胞間信息交流。

體細胞胚發(fā)生過程中β-1,3-葡聚糖酶活性變化及其作用，在誘導菊苣體細胞胚發(fā)生過程中有報道。研究者在菊苣體細胞胚發(fā)生過程中，監(jiān)測并確認了1種胞外38kD β-1,3-葡聚糖酶，該酶在胚性感受態(tài)或側期是穩(wěn)定的，在表達期該酶活性顯著增加，研究者從而推測該酶是體細胞從感受態(tài)向形態(tài)建成轉變的信使分子[32]。而本研究中刺五加胚性細胞也是在形態(tài)建成期，即球形胚形成期，β-1,3-葡聚糖酶活性顯著增加，但其特性需進一步研究。

3 結論與討論

刺五加從胚性愈傷組織到成熟子葉體細胞胚發(fā)生過程中，幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶2種防御性酶的活性均有顯著的變化。外切幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶活性均在球形體細胞胚形成過程中有顯著的增高，而后隨體細胞胚的進一步發(fā)育，均急劇下降，直到成熟子葉體細胞胚。相應的β-1,3-葡聚糖含量也是在球形體細胞形成期大量合成。由此可知，這2種防御性酶活性對體細胞胚的形態(tài)建成起重要作用。而內切幾丁質酶在整個體細胞胚發(fā)生、發(fā)育過程中均是持續(xù)增加的，該酶可能對體細胞胚發(fā)生不起主要作用。

在植物抗病菌方面，幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶作用往往是協(xié)同增效的[33]。例如，單獨的大豆中的幾丁質酶對大豆疫霉菌的抑制作用不明顯，單獨的β-1，3-葡聚糖酶及其與幾丁質酶混合，對大豆抗疫霉菌的抑制作用顯著[22]。在刺五加體細胞胚發(fā)生過程中，活性變化趨勢相對一致的外切幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶的作用關系有待進一步研究。

植物的體細胞胚發(fā)生是一個多因素事件，受各種內因和外因的作用。合適的外植體在適當?shù)耐饨缑{迫因素作用下誘導體細胞胚發(fā)生。本試驗中，該過程中的β-1,3-葡聚糖及其酶和外切幾丁質酶均對體細胞胚發(fā)生的關鍵時期——球形胚有重要的調控作用。葡聚糖可能主要對細胞起生理隔離作用，而β-1,3-葡聚糖酶和外切幾丁質酶可能均是體細胞胚形態(tài)建成的重要胞外信號因子。

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