夏書芹，張雅婷，張曉鳴，賈承勝

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

pH值對酪蛋白-葡聚糖共聚物膠束結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響

夏書芹，張雅婷，張曉鳴，賈承勝

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

酪蛋白膠束是天然的納米輸送系統(tǒng)，通過美拉德反應(yīng)獲得的酪蛋白-葡聚糖共聚物可解決酪蛋白膠束在等電點(diǎn)pH值范圍內(nèi)溶解性和乳化性低的問題。采用熒光光譜和動態(tài)激光光散射等手段研究經(jīng)超濾分離的酪蛋白-葡聚糖共聚物的聚集行為及其與pH值的關(guān)系。結(jié)果表明：酪蛋白-葡聚糖共聚物在酪蛋白質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL時開始自組裝形成膠束，形成膠束的結(jié)構(gòu)具有pH值依賴性。相比于其他pH值條件，等電點(diǎn)附近共聚物膠束的結(jié)構(gòu)最為致密且穩(wěn)定性良好，空間位阻效應(yīng)是維持其穩(wěn)定的主要原因。乳化性質(zhì)則表明，等電點(diǎn)附近的酪蛋白共聚物膠束的乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別提高了2.17倍和3.33倍。因此，酪蛋白-葡聚糖共聚物膠束對環(huán)境pH值的響應(yīng)性可為其在營養(yǎng)素納米載體領(lǐng)域的應(yīng)用提供更加多樣化的選擇。

酪蛋白；美拉德反應(yīng)；膠束；結(jié)構(gòu)；熒光光譜

新一輪的技術(shù)革命和產(chǎn)業(yè)革命正深入開展，納米技術(shù)也逐漸成為了食品工業(yè)發(fā)展的一個重要戰(zhàn)略平臺，并有望對傳統(tǒng)食品學(xué)科產(chǎn)生變革性的影響。目前食品工業(yè)正在努力嘗試將納米技術(shù)用于“從農(nóng)田到餐桌”的全過程，其中的一個重要分支是納米載體系統(tǒng)，該技術(shù)有望減少營養(yǎng)素的用量、提高其吸收利用率。納米載體系統(tǒng)技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用主要得力于以食品級或一般認(rèn)為安全材料如脂質(zhì)、蛋白以及多糖替代了納米藥物領(lǐng)域常用的具有一定副作用的聚合物和表面活性劑[1]。酪蛋白膠束是天然的納米輸送系統(tǒng)[2]，研究表明利用酪蛋白自組裝形成的納米膠束可以用來包埋、保護(hù)以及輸送脂溶性VD2[3]及姜黃色素[4]。然而天然酪蛋白在等電點(diǎn)附近的pH值條件下溶解性和乳化性較差[5]，這限制了其在酸性食品中的使用。通過美拉德反應(yīng)獲得的酪蛋白-多糖接枝共聚物具有卓越的界面性質(zhì)[6]，使其非常適合作為微膠囊及納米膠囊的壁材，以保護(hù)性質(zhì)敏感的營養(yǎng)素并達(dá)到靶向釋放的目的。Pan Xiaoyun等[7]研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物可通過疏水相互作用自組裝形成以酪蛋白為核、葡聚糖為殼的球形膠束，有效地包埋疏水性的β-胡蘿卜素。

分子結(jié)構(gòu)和環(huán)境因素的調(diào)節(jié)對蛋白-多糖接枝共聚物聚集體的形成與演變具有重要的影響，而聚集體結(jié)構(gòu)的變化可為其作為納米載體包埋釋放營養(yǎng)素這一功能應(yīng)用上提供更加多樣化的選擇。然而目前的報(bào)道多將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard reaction products，MRPs）作為整體研究其功能性質(zhì)的改善[8-9]，并未采取有效的分離措施將接枝共聚物與游離蛋白及多糖進(jìn)行分離，因此單一的共聚物在分子水平上的結(jié)構(gòu)、聚集特性以及結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的相關(guān)性至今未得到清楚闡述。由于共聚物膠束的形態(tài)主要由疏水鏈段的構(gòu)象、親水鏈段之間的相互作用以及疏水鏈段與溶劑之間的界面能3種作用力決定[10]，所以環(huán)境因素pH值通過在分子水平上調(diào)節(jié)共聚物鏈之間以及共聚物與溶劑之間的相互作用，從而使得蛋白-多糖共聚物對pH值的響應(yīng)會在其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上發(fā)生相應(yīng)的變化[11]。

本實(shí)驗(yàn)通過超濾分離出美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物，基于熒光光譜及動態(tài)光散射等手段，著重分析了酪蛋白-葡聚糖共聚物膠束的形成以及pH值對膠束結(jié)構(gòu)與粒徑分布、帶電性質(zhì)的影響，并初步探索了膠束結(jié)構(gòu)與乳化性的關(guān)系。以期從分子水平獲得有關(guān)酪蛋白-葡聚糖共聚物自組裝、以及膠束結(jié)構(gòu)和乳化性在pH值響應(yīng)方面的信息，旨在為酪蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在食品領(lǐng)域應(yīng)用的拓寬提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡聚糖（相對分子質(zhì)量40000） 上海滬試分析儀器有限公司；芘（熒光光譜級） 美國Sigma公司；玉米油 嘉里糧油有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CL20-B型冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Zetasizer Nano-ZS 90型納米粒度分析儀 英國Malvern公司；FJ200-S數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；UV-1600型紫外-可見分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；F-7000型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白-葡聚糖共聚物的制備

采用干法美拉德反應(yīng)制備酪蛋白-葡聚糖MRPs[12]。將酪蛋白和葡聚糖（物質(zhì)的量比1∶7）溶于1/15 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，攪拌，制成酪蛋白質(zhì)量濃度為8 mg/mL的均勻溶液，冷凍干燥48 h。干燥后的樣品磨細(xì)，過120目篩，置于培養(yǎng)皿中，用刺孔的鋁箔封口后進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為60℃，相對濕度為78%，pH值為7.0。達(dá)到反應(yīng)時間后，冷卻終止反應(yīng)。

將酪蛋白-葡聚糖MRPs溶于水，室溫下攪拌1 h后，在7 000 r/min離心30 min。取上清液調(diào)整上清液中酪蛋白質(zhì)量濃度0.1 mg/mL后，用截留相對分子質(zhì)量1×105的超濾膜反復(fù)超濾，收集大于相對分子質(zhì)量1×105的組分冷凍干燥，即得酪蛋白-葡聚糖共聚物。

1.3.2 熒光性質(zhì)的測定

1.3.2.1 同步熒光光譜測定

配制酪蛋白-葡聚糖共聚物溶液（采用考馬斯亮藍(lán)法分析蛋白含量，調(diào)整樣品中酪蛋白質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 mg/mL，pH 7），恒溫靜置l.0 h，激發(fā)波長和發(fā)射波長差（Δλ）分別設(shè)為60 nm和15 nm，在熒光發(fā)射和激發(fā)狹縫寬度均為5 nm的條件下，測定體系在波長280～400 nm范圍內(nèi)的同步熒光光譜。

1.3.2.2 內(nèi)源熒光發(fā)射光譜測定

配制酪蛋白-葡聚糖共聚物和混合物溶液（酪蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，pH 7），用1 mol/L HCl將溶液的pH值分別調(diào)節(jié)至2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0后，恒溫靜置1.0 h，在激發(fā)波長（λEx）為295 nm、熒光發(fā)射和激發(fā)狹縫寬度均為2.5 nm的條件下，測定酪蛋白在波長280～400 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜[13]。

1.3.2.3 外源熒光探針熒光發(fā)射光譜測定

以芘為熒光探針，移取10 μL儲備液（芘濃度1×10-4mol/L）于試管中，用氮?dú)獯蹈伞Ｒ迫肜业鞍?葡聚糖接枝物溶液（酪蛋白質(zhì)量濃度1 mg/mL），40℃水浴中超聲40 min，繼續(xù)孵育24 h。芘的最終濃度為10-6mol/L。在激發(fā)波長為338 nm、熒光發(fā)射和激發(fā)狹縫寬度均為2.5 nm的條件下，測定芘在波長350～550 nm范圍內(nèi)的穩(wěn)態(tài)熒光光譜。第1發(fā)射峰（373 nm附近）與第3發(fā)射峰（384 nm附近）的熒光強(qiáng)度之比值（Il/I3）可以表示芘所處微環(huán)境的極性。

1.3.3 粒徑分布及Zeta電位

采用動態(tài)激光光散射法能快速簡單地測定Zeta電位、粒徑分布。選擇配有He-Ne激光器（λ=633 nm）的Nano-ZS 90馬爾文粒徑分析儀分析，散射角為173°。將待測樣品分別裝入聚苯乙烯比色皿（折光指數(shù)1.33）和折疊毛細(xì)電解池中測定膠束平均粒徑和Zeta電位，測定溫度（25±0.1）℃，保溫3 min。

1.3.4 乳化性質(zhì)

將4 mL玉米油和12 mL酪蛋白-葡聚糖共聚物以及酪蛋白溶液（0.1 g/100 mL）混合后，10 000 r/min轉(zhuǎn)速下高速分散處理1 min形成均一的乳狀液，立即從底部取100 μL液體，用0.1%十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，SDS）稀釋50倍，漩渦混合5 s，測定500 nm波長的吸光度記為A0，10 min后測吸光度記為A10[14]。按照式（1）、（2）計(jì)算乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

式中：ρ為乳狀液形成前溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；I=0.01 m-2；φ為乳狀液中油相體積分?jǐn)?shù)（0.25）；A0為0 min樣品吸光度；A10為10 min樣品吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用軟件SPSS處理數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3次取平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。使用軟件Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白-葡聚糖共聚物膠束的形成

圖1 酪蛋白-葡聚糖共聚物同步熒光光譜Fig.1 Synchronous fluorescence spectra of casein-dextran conjugates

熒光光譜學(xué)主要是通過研究分析生物大分子本身具有的熒光發(fā)色團(tuán)（稱為內(nèi)源熒光探針）或通過標(biāo)記的外源熒光發(fā)色團(tuán)（稱為外源熒光探針），結(jié)合各種有關(guān)的熒光方法和技術(shù)來獲得生物大分子結(jié)構(gòu)、功能、相互作用等信息。具有內(nèi)源熒光的物質(zhì)不多，在蛋白質(zhì)分子中，能發(fā)射熒光的氨基酸有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）以及苯丙氨酸（Phe）。Trp、Tyr以及Phe由于其側(cè)鏈生色基團(tuán)的不同而呈現(xiàn)各異的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的熒光通常在280 nm或更長的波長被激發(fā)，而Phe在絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)條件下不被激發(fā)，所以很少能觀察到Phe的發(fā)射。這樣蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來自Trp和Tyr殘基[15]。蛋白質(zhì)的熒光譜圖對其所處的環(huán)境非常敏感，因此蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光可以作為研究蛋白-多糖共聚物性質(zhì)的有力手段。αs1-酪蛋白的色氨酸殘基位于164和199位，β-酪蛋白的色氨酸殘基位于143位，這3個氨基酸皆存在于酪蛋白分子的疏水部分，因此可提供酪蛋白-葡聚糖共聚物分子自組裝的重要信息[16]。色氨酸和酪氨酸的穩(wěn)態(tài)發(fā)射峰發(fā)生較大的重疊，選擇合適的Δλ，可得到Trp和Tyr的特征熒光光譜。當(dāng)Δλ較小時，299 nm附近的熒光峰為Tyr所貢獻(xiàn)，Δλ較大時，350 nm附近的熒光峰為Trp所貢獻(xiàn)[17]。

酪蛋白-葡聚糖共聚物溶液在Δλ為60 nm時的同步熒光光譜如圖1A所示。當(dāng)體系中蛋白質(zhì)量濃度在0.2～0.4 mg/mL范圍時，Trp殘基的發(fā)射峰熒光強(qiáng)度隨著酪蛋白質(zhì)量濃度的增加而呈近似線性的變化。當(dāng)酪蛋白質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL時，峰強(qiáng)度隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加趨勢變緩，這意味著當(dāng)體系中蛋白質(zhì)量濃度高于0.4 mg/mL時，共聚物在溶液中的存在狀態(tài)發(fā)生了改變。而隨著酪蛋白質(zhì)量濃度的增加，Trp的最大發(fā)射波長（λmax）從337.2 nm紅移到346.2 nm。酪蛋白-葡聚糖共聚物質(zhì)量濃度較低時，主要以單分子形式存在；而由于分子具有雙親特性，因此隨著質(zhì)量濃度的增加，分子通過疏水相互作用、氫鍵作用可自組裝形成膠束，從而導(dǎo)致了酪蛋白-葡聚糖共聚物分子中Trp殘基的最大發(fā)射波長的紅移以及發(fā)射強(qiáng)度偏離原來的線性關(guān)系遞增。

圖1B為酪蛋白-葡聚糖共聚物在Δλ=15 nm時的同步熒光光譜。譜圖表現(xiàn)為Tyr的特征譜圖，隨著共聚物質(zhì)量濃度的增加，最大發(fā)射波長由288 nm紅移到299 nm，與此同時，熒光強(qiáng)度在0.4 mg/mL達(dá)到最大后呈現(xiàn)下降趨勢，且在310～340 nm范圍內(nèi)有所增加。這表明，質(zhì)量濃度低于0.4 mg/mL時，酪蛋白-葡聚糖共聚物在溶液中主要以單體形式存在；當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL時，酪蛋白-葡聚糖共聚物通過自組裝形成聚集體，葡聚糖親水屏障對內(nèi)源熒光產(chǎn)生一定的屏蔽效應(yīng)。

2.2 pH值對酪蛋白-葡聚糖共聚物膠束結(jié)構(gòu)的影響

由于Trp位于酪蛋白分子的疏水微區(qū)[18]，因此pH值對Trp殘基的影響直接反映了pH值對酪蛋白-葡聚糖共聚物膠束結(jié)構(gòu)的影響。圖2為激發(fā)波長295 nm時，不同pH值條件下酪蛋白-葡聚糖共聚物的熒光光譜圖。最大發(fā)射波長λmax是判斷Trp殘基所處微環(huán)境疏水度的有力參數(shù)，λmax低說明其位于疏水度高的區(qū)域。

圖2 不同pH值條件下的酪蛋白-葡聚糖共聚物熒光發(fā)射光譜Fig.2 Fluorescence emission spectra of casein-dextran conjugates at different pH values

圖3 不同pH值條件下酪蛋白-葡聚糖共聚物和混合物的最大發(fā)射波長（A）及熒光強(qiáng)度（B）BFig.3 Plots of maximum emission wavelength (A) and fluorescence intensity (B) of casein-dextran conjugates and mixtures against pH

由圖3可知，在pH 3.5～5范圍內(nèi)λmax最低，而在pH 2～3.5范圍內(nèi)λmax略高，pH 6～7范圍內(nèi)λmax更高且隨著pH值的增加而增大。在pH 3.5～5范圍內(nèi)，Trp殘基所處的微環(huán)境疏水性最強(qiáng)從而導(dǎo)致了最低的λmax，膠束的結(jié)構(gòu)最為致密。pH 2～3.5范圍內(nèi)，λmax略高于等電點(diǎn)范圍，此時膠束的結(jié)構(gòu)較為致密。pH 2的λmax略低于pH 3的原因是部分氨基酸殘基質(zhì)子化，－NH3+中質(zhì)子化的H+形成氫鍵的能力要強(qiáng)于－NH2中的中性H原子，分子之間存在較強(qiáng)的氫鍵作用，導(dǎo)致酪蛋白-葡聚糖共聚物膠束在pH 2處的結(jié)構(gòu)較為致密。pH 6～7范圍內(nèi)，λmax更高且隨著pH值的增加而增大，該范圍內(nèi)膠束的結(jié)構(gòu)最疏松。這是由于隨著pH值的增加，酪蛋白分子上部分氨基酸的去質(zhì)子化削弱了酪蛋白-葡聚糖共聚物膠束形成過程中的鹽鍵和氫鍵作用，與此同時，較強(qiáng)的靜電排斥作用導(dǎo)致分子間距離的增加，從而使得結(jié)構(gòu)更加的疏松。pH 3.5～5范圍內(nèi)，與酪蛋白-葡聚糖混合物相比，酪蛋白-葡聚糖共聚物具有較低的λmax和較高的熒光強(qiáng)度，表明其中的Trp殘基處于疏水度較高的區(qū)域，這意味著pH值接近酪蛋白的等電點(diǎn)時，其具有更為致密的結(jié)構(gòu)。pH 2～3.5范圍內(nèi)，酪蛋白-葡聚糖共聚物相比于混合物有較高的λmax和較低的熒光強(qiáng)度，這是由于接枝的葡聚糖增加了分子之間的距離，削弱了－NH3+中質(zhì)子化的H+形成氫鍵的能力，較強(qiáng)的氫鍵作用導(dǎo)致酪蛋白-葡聚糖混合物膠束的結(jié)構(gòu)更致密。pH 5～7范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，Trp殘基的λmax均呈現(xiàn)增加的趨勢，然而酪蛋白-葡聚糖共聚物中Trp的λmax大于混合物的，這表明該pH值范圍內(nèi)酪蛋白接枝葡聚糖后具有比混合物更為疏松的結(jié)構(gòu)。

為進(jìn)一步研究pH值對共聚物膠束結(jié)構(gòu)的影響，選擇疏水性熒光探針芘。Il/I3值可用于衡量芘所處微環(huán)境的極性，Il/I3值越小，表明芘所處微環(huán)境的疏水性越強(qiáng)，因此，通過分析Il/I3隨pH值發(fā)生的變化可以間接地反映膠束結(jié)構(gòu)的pH值響應(yīng)性。

圖4 不同pH值條件下的酪蛋白-葡聚糖共聚物和混合物膠束中芘的I1/I3值Fig.4 Plot of I1/I3ratio of pyrene in casein-dextran conjugates and mixtures against pH

圖4 為酪蛋白-葡聚糖共聚物和混合物兩種膠束體系中芘的I1/I3隨著pH值發(fā)生的變化?；旌衔镏蠭l/I3在pH 2～7范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的波動，pH 2～3.5范圍內(nèi)正如內(nèi)源熒光的結(jié)果，此時混合物中酪蛋白膠束由于氫鍵作用增強(qiáng)因此具有較為致密的結(jié)構(gòu)，因此芘分子無法插入較深的疏水微區(qū)，從而導(dǎo)致了較高的Il/I3。pH 4～5范圍內(nèi)Il/I3明顯降低，且在pH 5時達(dá)到最小值，原因是pH值接近酪蛋白的等電點(diǎn)，分子凈電荷趨于0，膠束結(jié)構(gòu)由致密變得疏松后解體繼而形成宏觀上的聚集沉淀，從而使得Il/I3大幅度下降。pH 4～4.5和pH 5～6范圍內(nèi)酪蛋白膠束的解體和重新形成，導(dǎo)致了Il/I3大幅度的下降和上升。pH 6～7范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，部分氨基去質(zhì)子化，靜電斥力使膠束的結(jié)構(gòu)變得較為疏松，因此芘分子可以插入較深的疏水區(qū)域，從而獲得較低的Il/I3。

相比于混合物，酪蛋白-葡聚糖共聚物在pH 2～4范圍內(nèi)有略低的Il/I3，這是由于酪蛋白接枝葡聚糖后形成的屏障增加了酪蛋白分子之間的距離，削弱了氫鍵作用，因此形成較為疏松的結(jié)構(gòu)。pH 4～5范圍內(nèi)，Il/I3隨著pH值增加變化不明顯，這表明酪蛋白-葡聚糖共聚物形成的膠束在等電點(diǎn)附近并沒有發(fā)生類似酪蛋白膠束的解離聚集行為，這與膠束表面葡聚糖親水性屏障發(fā)揮的空間位阻效應(yīng)密切相關(guān)。當(dāng)pH 值趨近于5時，凈電荷趨于0，分子間斥力降低，酪蛋白分子亞基的聚集、多肽鏈的折疊使得共聚物反而形成了非常致密的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致芘分子無法插入更深的疏水微區(qū)，相應(yīng)的Il/I3有所升高。pH 5～7范圍內(nèi)，Il/I3隨著pH值的增加而減小，這同樣也歸因于部分氨基去質(zhì)子化，靜電斥力使膠束的結(jié)構(gòu)變得較為疏松，芘分子可插入較深的疏水區(qū)域。

2.3 pH值對酪蛋白-葡聚糖共聚物膠束的平均粒徑與帶電性質(zhì)的影響

酪蛋白在溶液中多以帶電單體的聚合形式存在，單體間依靠二硫鍵、疏水作用力、范德華力、氫鍵等作用力結(jié)合，粒子基本呈球形而非線狀，故其平均流體力學(xué)半徑最直觀地反映了溶液中蛋白的結(jié)構(gòu)特征[19]。酪蛋白膠束直徑約為50～500 nm，平均約150 nm[20]。Zeta電位則能夠從膠體粒子的微觀帶電特性說明膠體的穩(wěn)定性[21]。圖5所示為酪蛋白-葡聚糖共聚物和混合物的平均粒徑（圖5A）和Zeta電位（圖5B）隨環(huán)境溶液pH值的變化。

圖5 酪蛋白-葡聚糖共聚物和混合物的平均粒徑（A）及Zeta電位（B）隨pH值的變化Fig.5 pH dependence of Z-average diameter (A) and Zeta potential (B) of casein-dextran conjugates and mixtures

由圖5可知，在pH 2～4和pH 5～7范圍內(nèi)，混合物中的酪蛋白分別帶有凈的正電荷或者凈的負(fù)電荷，帶電的氨基酸殘基的靜電排斥和水合作用促進(jìn)了酪蛋白的溶解。且隨著酪蛋白所帶電荷的增加，分子間靜電斥力作用增強(qiáng)，分子間的距離增加，酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)疏松，粒徑略有增加。pH 4～5范圍內(nèi)，由于在等電點(diǎn)附近缺乏靜電排斥作用，粒徑顯著增大至微米級并出現(xiàn)宏觀的絮凝沉淀，酪蛋白葡聚糖混合物體系非常不穩(wěn)定，超出了檢測限，無法給出可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在pH 4～5范圍內(nèi)，雖然酪蛋白-葡聚糖共聚物膠束體系的Zeta電位較小，但其平均粒徑小于200 nm，未觀察到聚集現(xiàn)象。這與親水性的多糖增加了疏水蛋白和水分子之間的親和作用密切相關(guān)，且葡聚糖分子有助于提高疏水蛋白之間的空間位阻，抵消缺乏靜電排斥作用導(dǎo)致的變化，減少水中疏水蛋白之間的相互作用，從而阻止蛋白質(zhì)的聚集沉淀。而且在此pH值范圍內(nèi)，膠束的平均粒徑最小，表明酪蛋白-葡聚糖共聚物膠束結(jié)構(gòu)最為致密，這與熒光光譜結(jié)果相應(yīng)。比較發(fā)現(xiàn)，pH 4～7范圍內(nèi)，酪蛋白-葡聚糖共聚物Zeta電位的絕對值小于相應(yīng)的混合物，這是由于葡聚糖接枝到酪蛋白上后，高度水合的葡聚糖導(dǎo)致了酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物溶液的Zeta電位值減小[22]。

2.4 酪蛋白-葡聚糖共聚物的乳化性質(zhì)

圖6 酪蛋白-葡聚糖共聚物和混合物的乳化活性（A）及乳化穩(wěn)定性（B）隨pH值的變化Fig.6 pH dependence of emulsifying ability (A) and emulsion stability (B) of casein-dextran conjugates and mixtures

蛋白類大分子在納米乳等納米載體中的主要作用是降低油水界面張力、形成牢固的乳化膜、對難溶性營養(yǎng)素的增溶作用。由圖6可知，在pH 2～7范圍內(nèi)，酪蛋白-葡聚糖混合物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在等電點(diǎn)處達(dá)到最小值。在pH 4.5條件下，酪蛋白-葡聚糖共聚物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別達(dá)到221.7 m2/g和12.56 min，為混合物的3.17倍和4.33倍，這表明酪蛋白接枝葡聚糖后的結(jié)構(gòu)變化明顯改善了等電點(diǎn)pH值范圍內(nèi)酪蛋白的表面活性。這可以從兩方面來解釋：一方面，研究發(fā)現(xiàn)蛋白分子的柔韌性、表面疏水性和溶解性與乳化能力有一定關(guān)系，其中蛋白分子的柔韌性被認(rèn)為可能是決定蛋白乳化性質(zhì)最重要的因素[23]。在酪蛋白-葡聚糖共聚物為乳化劑的乳狀液中，接枝后酪蛋白分子pH值變化至等電點(diǎn)處使原有的結(jié)構(gòu)有所變化，分子能夠在乳化過程中快速移動到油水界面，降低了界面張力，而且能快速在界面展開重排，在油水界面更容易采用較適宜的構(gòu)象，從而發(fā)揮較好的乳化作用。另一方面，乳化活性受溶解性質(zhì)影響[24]，接枝蛋白表面親水性的葡聚糖有利于膠束的形成，糖分子對酪蛋白有保護(hù)作用。疏水性蛋白吸附在油相表面，而共價連接的大量親水性的葡聚糖插入水相中，其在乳化顆粒表面形成的乳化膜有一定的厚度和黏彈性，形成了空間穩(wěn)定層阻止油滴的聚合，賦予等電點(diǎn)處酪蛋白-葡聚糖共聚物較高的乳化穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

酪蛋白-葡聚糖共聚物溶液中，當(dāng)酪蛋白質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL時，分子開始自組裝形成膠束。形成的膠束在pH 2～7范圍內(nèi)均可保持結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定，且結(jié)構(gòu)對環(huán)境pH值具有響應(yīng)性。共聚物膠束的結(jié)構(gòu)在pH 3.5～5范圍內(nèi)最為致密，pH 2～3.5范圍內(nèi)較為致密，pH 5～7范圍內(nèi)最疏松。pH 3.5～5范圍內(nèi)膠束結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性良好，葡聚糖親水屏障賦予的空間位阻效應(yīng)是維持該范圍內(nèi)膠束穩(wěn)定的主要因素。同時，酪蛋白接枝葡聚糖后結(jié)構(gòu)的變化明顯改善了等電點(diǎn)處酪蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

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Effect of pH on the Structure and Property of Casein-Dextran Conjugate Micelles

XIA Shu-qin, ZHANG Ya-ting, ZHANG Xiao-ming, JIA Cheng-sheng
(College of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Casein micelle, as a natural nano-capsular vehicle for nutraceuticals, has the properties of low solubility and emulsifying ability at pH near the isoelectric point. Casein-dextran conjugates via Maillard reaction are expected to overcome these problems. In this work, the aggregation behavior and pH dependence of casein-dextran conjugates separated through ultrafiltration were explored by using fluorescence spectroscopy and dynamic light scattering. The results showed that casein-dextran conjugates began to self-assemble when the concentration of casein exceeded 0.4 mg/mL. The conjugated micelles had a compact structure or a relatively loose structure under different pH conditions. The structures of micelles at pH near the isoelectric point were the most compact, and presented a good stability due to the steric hindrance. Meanwhile, the emulsifying activity and emulsion stability of the conjugated micelles were increased by 2.17 and 3.33 times at pH near the isoelectric point, respectively. Therefore, the pH dependence of casein-dextran conjugate micelles might provide more choices for their use in the field of nutraceutical nanocarriers.

casein; Maillard reaction; micelles; structure；fluorescence spectroscopy

TS255.5

A

1002-6630（2014）05-0037-06

10.7506/spkx1002-6630-201405008

2013-01-17

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD23B04）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

夏書芹（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：sqxia@jiangnan.edu.cn