劉曉飛，劉 寧，張 娜，荊麗榮，于茲冰，馬永強

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

超聲波輔助酶法提取甜玉米穗軸黃酮及抑菌性檢測

劉曉飛，劉 寧，張 娜，荊麗榮，于茲冰，馬永強

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

以甜玉米穗軸為原料，利用超聲波輔助纖維素酶法提取其中的黃酮類物質，考察纖維素酶作用的酶解時間、酶解溫度、pH值以及酶用量對甜玉米穗軸中黃酮類物質提取效果的影響。結果表明：超聲波輔助纖維素酶法提取黃酮類物質最佳工藝條件為：超聲處理20 min后，酶解溫度55 ℃、pH 4.8、纖維素酶用量0.008 g/2.0 g甜玉米穗軸、酶解時間1.5 h，此條件下甜玉米穗軸中黃酮類物質提取率0.318%。甜玉米穗軸中黃酮類物質對白葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有明顯的抑制作用，最低抑菌質量濃度分別為0.5、0.25、2 mg/mL。

甜玉米穗軸；黃酮；超聲波輔助酶法；抑菌活性

甜玉米穗軸俗稱玉米芯，是玉米果穗脫去籽粒后的穗軸，占玉米穗20%～30%。我國玉米年產(chǎn)量位于美國之后，居世界第二位[1-2]，按3 kg玉米產(chǎn)1 kg玉米芯計算，僅2013年我國產(chǎn)生的玉米芯近0.72億 t。目前利用率僅有10%～15%[3]，絕大部分玉米芯作為農家燃料被燒掉，造成資源浪費。

植物黃酮類化合物是一類重要的天然有機化合物，是植物長期自然選擇過程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物[4]，它具有抗病毒、抗腫瘤、延緩衰老及降血糖、降血壓、降血脂、抗炎鎮(zhèn)痛等作用[5]。黃酮類化合物還是一種天然的抗氧化劑，具有抗氧化和清除自由基抗衰老作用，已成為人類膳食中的一種不可或缺的抗氧化營養(yǎng)因子[6-9]，它在替代人工合成抗氧化劑成為未來油脂或含油食品添加劑方面擁有巨大潛力[10-12]。甜玉米穗軸中含有黃酮類物質，最高含量可達0.05 mg/g[13]。

黃酮的提取方法有水浸提法、索氏提取法、滲透法、水蒸氣蒸餾法、超聲波提取法、酶法等[14-19]。超聲波能在液體中高頻振動并產(chǎn)生“空穴作用”，可以破壞細胞組織，有助于黃酮類化合物的溶出和擴散，具有提取時間短、效率高的優(yōu)點[20-21]。酶法是近年來運用較多的一種技術，使提取液發(fā)生酶解反應，破壞組織細胞，降低提取條件，從而有利于有效成分的提取，提高提取率[22-23]。為充分利甜玉米穗軸資源，本研究采用超聲波輔助酶法從甜玉米穗軸中提取黃酮類化合物，確定最佳提取工藝條件，并測定其抑菌活性，為今后甜玉米芯的開發(fā)利用及工業(yè)化生產(chǎn)天然抗氧化劑提供理論依據(jù)和方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜玉米穗軸 哈爾濱市郊區(qū)；纖維素酶（150 000 U/g） 和氏璧生物技術有限公司；蘆丁中國食品藥品檢定研究院；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑均為分析純。

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白葡萄球菌由哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院保存。

1.2 儀器與設備

Y92-2D超聲波細胞粉碎儀 寧波新知生物科技股份有限公司；紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；高速離心機 上海安亭科技儀器廠；電熱恒溫干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線

量取120 ℃干燥至恒質量的蘆丁標準品20 mg，用甲醇溶解，定容在100 mL的容量瓶中，制備成0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液備用。

吸取蘆丁標準液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別加入質量分數(shù)5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min后加入質量分數(shù)10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；最后加入質量分數(shù)10%氫氧化鈉溶液10 mL，用蒸餾水定容至25 mL，定容后的溶液放置15 min后，在510 nm波長處測定吸光度，并做空白對照。以蘆丁標準液質量濃度為橫坐標，相應的吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2 超聲波輔助纖維素酶法提取甜玉米穗軸黃酮單因素試驗

選擇新鮮、無蟲蛀、無霉變的甜玉米穗軸，粉碎過80 目篩子，烘干至恒質量備用。準確稱取粉碎后的甜玉米穗軸樣品2.0 g，按料液比1∶20加入蒸餾水后，使用功率520 W的細胞破碎儀作用20 min，停止超聲，加入纖維素酶?？疾烀附鈺r間、酶用量、酶作用pH值、酶解溫度4 個單因素對總黃酮提取率的影響[24]。

黃酮的提取率按照下面公式計算：

1.3.3 超聲波輔助纖維素酶法提取甜玉米穗軸黃酮正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，設計正交試驗并優(yōu)化黃酮的工藝參數(shù)，如表1所示。將正交試驗得出的最佳條件進行驗證。

表1 正交試驗因素水平表Table1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.4 甜玉米穗軸中黃酮的抑菌性測定

1.3.4.1 紙片法測定黃酮的抑菌圈[25]

使用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白葡萄球菌測定甜玉米穗軸中黃酮的抑菌性，將菌種接種到液態(tài)培養(yǎng)基上進行活化，用無菌水將菌液稀釋至0.5麥氏濁度后備用。將黃酮粗提液分別配制成質量濃度0.5、1、2 mg/mL的溶液，以不加黃酮為對照，過濾除菌，備用。

在超凈工作臺上，將滅菌的直徑為10 mm圓形濾紙片，浸泡在提取的甜玉米穗軸黃酮液中30 min。分別取約0.4 mL菌懸液，均勻涂布在固體瓊脂平板上，再取浸有黃酮液的濾紙片貼在含菌平板上。每個平皿貼2個濾紙片，重復3 次。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察黃酮的抑菌效果，并測量抑菌圈直徑，計算平均值。

1.3.4.2 瓊脂稀釋法測定黃酮的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[26]

將黃酮粗提液配制成質量濃度1.25、2.5、5、10、20 mg/mL的供試液，過濾除菌后按瓊脂-黃酮（9∶1，m/m）的比例加入融化的MHA瓊脂（muller hinton agar，MHA），混勻倒板，得到含黃酮分別為0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL的瓊脂平板。用移液槍逐一點種供試菌液10 μL，菌液干后置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，菌落生長被完全抑制的最低藥物質量濃度為該黃酮液對檢測菌的MIC。每個受試樣平行重復3 次，以不含黃酮的瓊脂板作對照。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的回歸方程

由不同質量濃度的蘆丁標準液得到的線性方程為：y=5.529 8x＋0.002 2，r2=0.999 3。

2.2 超聲波輔助酶法提取甜玉米穗軸黃酮工藝的單因素試驗

2.2.1 酶用量對甜玉米穗軸黃酮提取率的影響

圖1 不同加酶量對黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of cellulose dose on the extraction yield of flavonoids

如圖1所示，當酶用量為0.008 g時，黃酮提取率達到最高，隨著酶添加量的增加，黃酮提取率沒有明顯提高，說明溶液中酶添加量已接近飽和，繼續(xù)提高酶添加量，對提取率影響不明顯。因此酶添加量選擇0.008 g。

2.2.2 pH值對甜玉米穗軸黃酮提取率的影響

圖2 酶解pH值對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of pH on the extraction yield of flavonoids

如圖2所示，在pH值為4.0時，黃酮提取率最低，隨著pH值的升高而逐漸增加，在pH值為4.8時，提取率達到最高，而后隨著pH值的升高，反而提取率下降。因為酶活力受環(huán)境的影響，pH值不僅影響酶的構象，而且也影響底物的解離狀態(tài)。pH值為4.8時，纖維素酶處于最佳pH值區(qū)間，能夠發(fā)揮纖維素酶的最大活力，使之最大限度作用于細胞壁纖維素。因此酶解的最佳pH值選擇為4.8。

2.2.3 酶解溫度對甜玉米穗軸黃酮提取率的影響

圖3 酶解溫度對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the extraction yield of flavonoids

如圖3所示，在40～50 ℃隨著溫度的升高，黃酮提取率不斷增加，當溫度達到50 ℃時，黃酮提取率最高；在55 ℃時黃酮提取率減少。因為當溫度升高到一定程度時，酶蛋白受熱變性，從而影響對細胞的分解，降低了黃酮提取率。因此酶解最佳溫度選擇為50 ℃。

2.2.4 酶解時間對甜玉米穗軸黃酮提取率的影響

圖4 不同酶解時間對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on the extraction yield of flavonoids

如圖4所示，隨著時間的延長，黃酮提取率增加，酶解1.5 h后，提取率增加緩慢，因為此時的細胞壁已基本被破壞，再延長酶解時間，提取率增加的幅度不是很大。本著節(jié)約時間的原則，選用酶解時間為1.5 h。

2.2.5 超聲波輔助酶法提取甜玉米穗軸黃酮工藝的正交試驗及驗證結果

表2 正交試驗設計及結果Table2 Scheme and results of orthogonal array design

由表2可以知，最佳提取條件為A2B3C2D2，即酶解時間為1.5 h、酶解溫度為55 ℃、pH值為4.8、酶用量為0.008 g較為適合；各因素對黃酮類物質提取率的影響的主次順序依次為pH值＞酶用量＞酶解溫度＞酶解時間。在此條件下，甜玉米穗軸中黃酮的最佳提取率為0.298%，正交試驗驗證結果得到黃酮的提取率為0.318%，比文獻[27]報道中使用乙醇作為溶劑，振蕩法提取的玉米芯黃酮提取率分別提高11.2%。原因在于超聲波劇烈振蕩產(chǎn)生的空化作用會產(chǎn)生相當大的破壞應力，破壞細胞壁結構，使纖維素酶充分作用在細胞壁上，能夠使黃酮充分暴露出來，同時機械振動作用還能夠加快黃酮在媒介中的傳遞擴散。因此，黃酮的提取率有所提高。

2.3 甜玉米穗軸中提取率黃酮的抑菌性結果

表3 甜玉米穗軸黃酮抑菌實驗結果Table3 Antibacterial activities of flavonoids from sweet corncobs

如表3所示，甜玉米穗軸黃酮對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白葡萄球菌均有一定的抑制作用。其中對枯草芽孢桿菌的抑制作用最強，MIC為0.25 mg/mL；其次為大腸桿菌MIC為0.5 mg/mL，白葡萄球菌MIC為2 mg/mL。甜玉米穗軸中黃酮對大腸桿菌的MIC是文獻[28]報道的橄欖中黃酮MIC的1 倍，是枯草芽孢桿菌的MIC的0.5 倍。

3 結 論

本實驗以來源豐富的甜玉米穗軸為原料，利用超聲波輔助纖維素酶法提取甜玉米穗軸中的黃酮，采用L9（34）正交試驗設計優(yōu)選擇出最佳工藝條件：酶解溫度55 ℃、pH值4.8、纖維素酶用量0.008 g/2 g甜玉米穗軸、酶解時間1.5 h，此條件下甜玉米穗軸的黃酮提取率為0.318%。甜玉米穗軸中黃酮類物質對白葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有明顯的抑制作用，加之我國甜玉米產(chǎn)量巨大，甜玉米穗軸黃酮用來作為天然食品防腐劑前景廣闊。

[1] 胡葉碧, 王璋. 纖維素酶和木聚糖酶對玉米皮膳食纖維組成和功能特性的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2006, 27(11): 103-105.

[2] 張靜文, 張鳳清, 張培剛, 等. 玉米芯多糖的提取及其單糖組成研究[J].食品工業(yè)科技, 2010, 31(3): 242-244.

[3] 石波, 李里特. 玉米芯酶法制取低聚木糖的研究[J]. 中國農業(yè)大學學報, 2001, 6(2): 92-95.

[4] MORIMOTO M, TANIMOTO K, NAKANO S, et al. Insect antifeedant activity of flavones and chromones against Spodoptera litura[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(2): 389-393.

[5] 于晶, 郝再彬, 蒼晶, 等. 黃酮類化合物的活性研究進展[J]. 東北農業(yè)大學學報, 2008, 39(12): 125-130.

[6] 王文淵, 周振華, 龍紅萍. 復合酶法提取苦瓜葉總黃酮的研究[J]. 中國食品添加劑, 2011(4): 107-112.

[7] 肖崇厚, 楊松松, 洪筱坤. 中藥化學[M]. 上海: 上?？茖W技術出版社, 1997: 256-274.

[8] 張春紅, 許寧, 吳雙, 等. 纖維素酶-微波輔助提取軟棗獼猴桃莖黃酮的工藝優(yōu)化[J]. 食品科學, 2012, 33(8): 24-28.

[9] HABTEMARIAM S. Flavonoids as inhibitors or enhancers of the cytotoxi city of tum or Necris is fact -alpha in L-929 tum or cells[J]. Journal of Natural Products, 1997, 60(8): 775-778．

[10] 張俊生, 陳莉華, 侯孝璇, 等. 超聲波輔助乙醇提取垂盆草中總黃酮及其抗氧化活性[J]. 食品科學, 2012, 33(8): 18-23.

[11] 萬忠民, 鞠興榮, 姚琦, 等. 中草藥提取物對油脂抗氧化的比較研究[J].食品科學, 2006, 27(11): 89-92.

[12] 鄧斌, 王存嫦, 徐安武. 微波輔助提取花生殼黃酮類化合物及其抗氧化性研究[J]. 中國油脂, 2009, 34(3): 54-57.

[13] 陳家明, 余穩(wěn)穩(wěn), 吳暉, 等. 玉米芯的營養(yǎng)成分分析[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2012, 28(9): 1073-1075.

[14] 王雪鋒, 單美娟, 韓曜平, 等. 鴨血糯中黃酮類化合物提取工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(12): 284-286.

[15] 賴毅勤, 周宏兵. 近年來黃酮類化合物提取和分離方法研究進展[J].食品與藥品, 2007, 9(4): 54-58.

[16] 劉海鵬, 劉延成, 馬東升, 等. 超聲波/回流法銀杏葉總黃酮提取的研究[J]. 化學工程師, 2005(8): 49-50.

[17] 霍丹群, 張文. 超聲波法與熱提取法提取山楂總黃酮的比較研究[J].中成藥, 2004, 26(12): 1063-1065.

[18] 楊志剛, 張燕萍, 楊海定. 超聲波輔助提取常熟黑米類黃酮及其抗氧化活性分析[J]. 食品科學, 2013, 34(18): 118-122.

[19] 王曉, 張紅俠, 王其亮. 酶法提取山楂葉中總黃酮的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2002, 23(3): 37-39.

[20] 喬孟, 屈曉清, 丁之恩. 響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取湖北海棠葉中總黃酮工藝[J]. 食品科學, 2013, 34(2): 143-147.

[21] WEI Lingyun, WANG Jianhua, ZHENG Xiaodong, et al. Studies on the extracting technical conditions of inulin from Jerusalem artichoke tubers[J]. Journal of Food Engineering, 2007, 79(3): 1087-1093.

[22] 王巖巖, 李文娟. 纖維素酶提取陳皮黃酮的工藝條件[J]. 食品與生物技術學報, 2008, 27(2): 71-74.

[23] 彭晶, 楊穎, 牛付閣, 等. 響應曲面法優(yōu)化大高良姜黃酮酶法提取工藝[J]. 食品科學, 2013, 34(14): 169-172.

[24] 馬燮, 李敏, 楊虎, 等. 正交試驗優(yōu)選葉下珠中黃酮類化合物的提取工藝[J]. 食品研究與開發(fā), 2008, 29(11): 117-119.

[25] 馬永強, 荊麗榮, 劉曉飛, 等. 雙水相超聲波法輔助提取甜玉米芯多酚及抑菌性研[J]. 食品科學, 2013, 34(24): 61-64.

[26] 宋曉勇, 劉強, 楊磊, 等. 蒲公英多糖提取工藝及其抗菌活性研究[J].中國藥房, 2010, 21(47): 4453-4455.

[27] 常麗新, 賈長虹, 郁春樂. 響應面優(yōu)化玉米芯黃酮的提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技, 2014, 35(2): 259-263.

[28] 曲中堂, 項昭保, 趙志強. 橄欖總黃酮抑菌作用研究[J]. 中國釀造, 2010, 29(4): 62-64.

Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction and Antimicrobial Activity of Sweet Corncob Flavonoids

LIU Xiao-fei, LIU Ning, ZHANG Na, JING Li-rong, YU Zi-bing, MA Yong-qiang
(College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Flavonoids were extracted by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis of sweet corncobs using cellulase and the optimal extraction conditions were established by orthogonal array design. An ultrasonication time of 20 min followed by enzymatic hydrolysis at 55 ℃ and pH 4.8 for 1.5 h with an enzyme dosage of 0.008 g/2.0 g substrate provided maximum extraction yield of 0.318%. The flavonoids extracted from sweet corncobs had significant antibacterial activity against white Staphylococcus, Escherichia coli and Bacillus subtilis. The minimum inhibitory concentrations were 0.5, 0.25 and 2 mg/mL respectively.

sweet corncob; flavonoids; ultrasonic-assisted enzymatic extraction; antibacterial activity

TS209

A

1002-6630（2014）20-0079-04

10.7506/spkx1002-6630-201420016

2014-02-08

哈爾濱商業(yè)大學博士科研啟動項目（12DL014）

劉曉飛（1980—），女，講師，博士，研究方向為農產(chǎn)品加工利用。E-mail：liuxiaofei72@163.com