韓 深，劉 鑫，李建輝，王珮玥，古 瑾，張朝暉*

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 100026）

超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜快速篩查和確證食用貝類中多種原多甲藻酸貝類毒素

韓 深，劉 鑫，李建輝，王珮玥，古 瑾，張朝暉*

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 100026）

建立超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜快速篩查和確證貽貝、牡蠣、蚌類、扇貝等食用貝類及其制品中3種天然形式的原多甲藻酸貝類毒素的檢測方法。樣品中的原多甲藻酸采用乙腈-水體系均質(zhì)提取，應(yīng)用改進(jìn)型QuEChERS技術(shù)凈化，在乙腈-水（含5 mmol/L醋酸銨和0.1%甲酸）體系經(jīng)Acquity HSS T3柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)了3種原多甲藻酸貝類毒素的基線分離。該方法基于電噴霧正離子模式，采用高分辨質(zhì)譜一級全掃描和數(shù)據(jù)依賴掃描，對食用貝類及其制品樣品中的原多甲藻酸貝類毒素進(jìn)行檢測。3種貝類毒素的定量限均為10 μg/kg（RSN＞10）；在10～500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。應(yīng)用該方法對國內(nèi)外多個地區(qū)的貝類產(chǎn)品進(jìn)行了篩查及確證，其中部分樣品檢出原多甲藻酸貝類毒素。該方法靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡便、快捷，適用于食用貝類及其制品中多種原多甲藻酸貝類毒素的篩查分析。

原多甲藻酸貝類毒素；超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜；QuEChERS

自20世紀(jì)末期，隨著全球工業(yè)化進(jìn)程飛速發(fā)展，海洋環(huán)境遭受嚴(yán)重污染，其中由有毒赤潮產(chǎn)生的藻毒素成為污染海水養(yǎng)殖環(huán)境的新要素，嚴(yán)重威脅到水產(chǎn)品食用安全[1]。原多甲藻酸貝類毒素（azaspiracids shellfish toxins，AZAs）是近年來先于歐洲發(fā)現(xiàn)的一類新型聚醚類生物毒素[2]，1995年在愛爾蘭Killary海灣的紫貽貝中首次被檢測到，它是一種具有6,5,6-三螺環(huán)和環(huán)胺結(jié)構(gòu)的親脂性聚醚類海洋生物毒素[3-4]，結(jié)構(gòu)式見表1。

目前已確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的原多甲藻酸貝類毒素已有11種，其中屬AZA-1、AZA-2及AZA-3是最常見且毒性最大的3種[3,5]。AZAs主要引起人體胃腸道紊亂，通常在進(jìn)食12～24 h后發(fā)作，此外，AZAs還能導(dǎo)致多種器官損傷，且這類毒素相對比較穩(wěn)定，在酸性、堿性和高溫條件都不能使其毒性降低[6]。據(jù)估算，當(dāng)攝入AZA-1劑量為23 ?g/人和86 ?g/人時，致毒概率分別為5%和95%，對人的平均致毒劑量為51.7 ?g/人[7]。2004年，由聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和政府間海洋委員會共同組建了服務(wù)于漁業(yè)和水產(chǎn)品法典委員會的雙殼軟體生物毒素工作組，將原多甲藻酸歸為八大類貝類生物毒素之一[8]。鑒于原多甲藻酸貝類毒素的危害性，歐盟立法機(jī)構(gòu)確立雙殼軟體動物中AZAs的最大允許限量是160 ?g/kg[9]。

目前報道的原多甲藻酸的檢測方法主要包括：生物測試法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。采用生物法進(jìn)行檢測，往往會產(chǎn)生假陰性結(jié)果而造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確[10]。液相色譜技術(shù)是分析生物毒素的一類高效的手段，但由于AZAs毒素在波長大于210 nm的范圍缺少特征吸收峰，因此目前還未見相關(guān)采用液相色譜分析AZAs的報道。隨著液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技術(shù)的發(fā)展和不斷完善，人們逐漸嘗試建立了一些LC-MS分析方法來測定這類毒素[11-l6]，由于貝類海產(chǎn)品及其制品基質(zhì)較為復(fù)雜，采用單級質(zhì)譜測定的結(jié)果可能會產(chǎn)生假陽性。線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜由于具有質(zhì)量分辨率高和精確分子質(zhì)量的功能，最近成為人們研究和應(yīng)用的新熱點(diǎn)。該方法在全掃描模式下采集的數(shù)據(jù)可以根據(jù)檢測需求反復(fù)調(diào)用，因此其可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)低分辨質(zhì)譜方法無法應(yīng)對法規(guī)更新頻繁的不足；其數(shù)據(jù)依賴性掃描可以在篩查的同時，通過碎片離子進(jìn)行定性確證。

本實(shí)驗(yàn)基于QuEChERS前處理技術(shù)，運(yùn)用超高效液相色譜和高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對貽貝、牡蠣、蚌類、扇貝等食用貝類及其制品中3種天然形式的原多甲藻酸貝類毒素進(jìn)行分析測定。相比低分辨率質(zhì)譜，運(yùn)用高分辨質(zhì)譜一級全掃描和數(shù)據(jù)依賴掃描進(jìn)行檢測分析，在很大程度上降低了出現(xiàn)假陽性結(jié)果的可能性，使檢測更加準(zhǔn)確。同時，采用超高壓液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離，不但節(jié)省試劑消耗，更提高了分析效率，3個毒素化合物在10 min內(nèi)可完成分析，較好地實(shí)現(xiàn)了對貽貝、蚌類等的可食用貝類及其制品基體中3種AZAs貝類毒素的分析與測定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

貽貝、牡蠣、象拔蚌和扇貝4種食用貝類及其制品市售。

3種原多甲藻酸標(biāo)準(zhǔn)品AZA-1、AZA-2和AZA-3（純度均≥99.0%） 美國Supelco公司（表1）；乙腈、乙酸銨、甲醇、乙酸乙酯（均為色譜純） 美國Fisher公司；甲酸（色譜純） 美國Tedia公司；無水硫酸鎂、氯化鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；C18基質(zhì)固相分散萃取分散劑 美國Agilent公司；微纖維濾紙 美國Vicam公司；微孔濾膜（0.2 μm） 美國Whatman公司；超純水（電阻率為18.2 MΩ）經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)過濾。用甲醇配制3種原多甲藻酸貝類毒素的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－20 ℃條件下保存，保存期為6個月；配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時，根據(jù)要求將儲備液稀釋成不同質(zhì)量濃度，于－20 ℃條件下保存，工作曲線現(xiàn)用現(xiàn)配。

Orbitrap超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo Fisher Scientif c公司；高速均質(zhì)機(jī) 美國Waring公司；離心機(jī) 美國Sigma公司；漩渦混勻器 德國IKA公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Eyela公司；Milli-Q超純水裝置 美國Millipore公司。

表1 3種原多甲藻酸貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)對照品信息Table 1 Information about 3 azaspiracid standards

1.2 方法

1.2.1 色譜-質(zhì)譜條件

1.2.1.1 色譜條件

色譜柱：Acquity HSS T3柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈（A）和水溶液（含5 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸）（B）；流速：250 μL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。梯度洗脫程序：0～1 min，20%～50% A；1～6 min，50%～90% A；6～7 min，90% A；7～7.5 min，90%～20% A。

1.2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI）；掃描方式：正離子掃描；鞘氣流量：35 arb；輔助氣流量：6 arb；噴霧電壓：4.8 kV；毛細(xì)管溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：30 V；透鏡電壓：55 V；分辨率：60 000；HCD相對碰撞能量：23%；鞘氣、輔助氣、C-trap碰撞氣類型：氮?dú)狻?/p>

1.2.2 樣品前處理

由于AZAs在貝類的肌肉和內(nèi)臟等組織中的富集程度各不相同，如AZA-1主要分布于消化腺，而AZA-3則主要分布于消化腺以外的其他組織[3]，因此在取樣時，應(yīng)取除外殼的整個部分（包含肌肉和內(nèi)臟）作為試樣，以確保樣品的均一性和代表性。

1.2.2.1 試樣制備

用尖銳物品將試樣去殼，將沙土及其他固體顆粒用清水沖洗去掉，瀝干后稱取200 g洗凈的樣品，置于潔凈的密封袋中，放入－20 ℃的冰箱中保存，避免試樣間的交叉污染。

可直接食用的樣品直接稱取即可。

1.2.2.2 提取和凈化

準(zhǔn)確稱取制備好的試樣10 g（精確至0.01 g）于均質(zhì)杯中，分別加入25 mL 85%乙腈-水提取液，5 g無水硫酸鎂和2 g氯化鈉，在20 000 r/min條件下均質(zhì)60 s，用微纖維濾紙過濾，取10 mL濾液至離心管中，加入0.5 g C18基質(zhì)固相分散萃取凈化劑和1 g無水硫酸鎂，旋渦振蕩1 min，7 000 r/min離心5 min，取5 mL清液移至錐形瓶中，40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，以0.8 mL乙腈和0.2 mL水溶解，旋渦振蕩30 s，過0.2 μm微孔濾膜，待儀器分析測定。

1.2.3 空白實(shí)驗(yàn)及回收率實(shí)驗(yàn)

選用不含上述3種原多甲藻酸貝類毒素的扇貝樣品，分別添加3個水平（50、75 μg/kg和100 μg/kg）的原多甲藻酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按上述步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計算回收率結(jié)果。

選取純水代替試樣，按照上述步驟進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，原多甲藻酸貝類毒素是一類脂溶性聚醚化合物，易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，實(shí)驗(yàn)分別考察乙酸乙酯、甲醇、乙腈3種提取液的提取效率，結(jié)果表明，乙腈的提取效率相比較好。但由于貝肉中富含大量的蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)，使用100%乙腈進(jìn)行提取時，會增加粗提液中干擾雜質(zhì)的比例，給凈化步驟增加難度，因此，實(shí)驗(yàn)還比較了85%乙腈-水體系的提取效果，結(jié)果表明，85%的乙腈-水體系的提取效果與乙腈體系相當(dāng)，但更有利于凈化，見表2。

表2 加標(biāo)量均為100 g/kg的牡蠣樣品在不同提取條件下3種AZAs的檢測結(jié)果（ =6）Table 2 Recovery of 3 AZAs extracted from oyster samples spiked at 100 g/kg by different methods under different conditions ( =6) μg/kg

常見的樣品提取方式主要有振蕩提取、均質(zhì)提取、超聲提取等，實(shí)驗(yàn)分別考察不同提取方式對提取的影響，且在同一條件下，還考察了提取時間和溫度的影響，結(jié)果表明，均質(zhì)提取的效果較好，延長提取時間在一定程度上能夠幫助提高提取效率，提取溫度對效率的影響不顯著，見表2。

通過正交試驗(yàn)最終確定了前處理?xiàng)l件，室溫條件下，以乙腈-水溶液作為提取液，采用高速均質(zhì)儀器將樣品均質(zhì)60 s，待凈化。

2.2 分散劑和鹽的用量對提取效率的影響

QuEChERS凈化技術(shù)是一種通用性強(qiáng)、快速且簡便的前處理方法，近幾年來被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、毒素等檢測中[17-22]，本實(shí)驗(yàn)以貝類樣品的基質(zhì)特點(diǎn)為基礎(chǔ)，參照QuEChERS的基本原理進(jìn)行了改進(jìn)，并得到了較為滿意的結(jié)果。

圖1 MgSO4加入量（A）和NaCl加入量（B）對4種貝類產(chǎn)品基質(zhì)中AZA-1提取效率的影響Fig.1 Effects of the amounts of added MgSO4and NaCl on extraction efficiency of AZA-1 in 4 shellfish matrixes spiked at 100 ?g/kg

為了幫助提高提取效率，實(shí)驗(yàn)加入了無水硫酸鎂和氯化鈉。無水硫酸鎂能夠幫助目標(biāo)化合物在提取溶液中更好的分散，使提取更加容易；氯化鈉則能夠使溶液體系中的水趨于相飽和，促使目標(biāo)化合物分散至有機(jī)相并有助于水和乙腈相分層，從而提高提取效率[23-27]。實(shí)驗(yàn)分別考察了無水硫酸鎂和氯化鈉的加入量對提取效率的影響，結(jié)果表明，5 g無水硫酸鎂和2 g氯化鈉的加入即能夠獲得較好地提取效率，見圖1。

2.3 凈化方式的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用了基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)進(jìn)行凈化處理，分析比較Florisil、C18、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳黑（graphitized carbon blacks，GCB）等幾種常用凈化劑的凈化效果[28-34]，F(xiàn)lorisil作為強(qiáng)極性吸附劑，無法去除提取液中的脂類雜質(zhì)，AZAs的回收率偏低；GCB通常用于去除色素成分，因其可吸附較強(qiáng)的帶苯環(huán)官能團(tuán)的化合物[35]，且AZAs的結(jié)構(gòu)中含有大量苯環(huán)，因此3種AZAs的回收率小于40%；PSA能有效去除基質(zhì)中的脂肪酸和甾醇類基質(zhì)，但考慮到PSA作為堿性吸附填料對酸性化合物有較強(qiáng)吸附作用，AZAs恰好屬于酸性化合物，因此吸附較為牢固，若要使用該類型的凈化劑，提取時需添加一定的酸以減少損失[36]；C18可有效去除脂類、糖類等親脂型雜質(zhì)，對AZAs這類化合物的適用性較好，但過量的C18也會吸附目標(biāo)化合物而使回收率降低，因此，需要對C18凈化劑的使用量進(jìn)行優(yōu)化。幾種凈化劑各有特點(diǎn)，需要在檢測靈敏度、最佳凈化效果和合理回收率之間尋求平衡點(diǎn)。因此，實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化最終確定了使用C18凈化劑（按照實(shí)驗(yàn)確定的最終前處理步驟，每20 g樣品加入1 g凈化劑），并配以1 g無水硫酸鎂可以達(dá)到較好的凈化效果。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

圖2 3種AZAs的參考色譜圖Fig.2 Chromatograms of three AZAs standards

為了獲得目標(biāo)化合物最好的色譜分析效果，考察了乙腈-水和甲醇-水兩種混合溶劑體系作為流動相時目標(biāo)化合物的色譜行為。結(jié)果表明，使用甲醇-水體系作為流動相時，85%以上比例的甲醇才可將目標(biāo)化合物洗脫下來，當(dāng)甲醇比例達(dá)到90%時，3種原多甲藻酸貝類毒素就無法實(shí)現(xiàn)基線分離了，由于乙腈的洗脫能力較強(qiáng)，當(dāng)采用乙腈-水體系作為流動相時，3種AZAs在7 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)基線分離，見圖2。

2.5 質(zhì)譜條件的確定

根據(jù)歐盟2002/657/EC指令，采用三重四極桿質(zhì)譜儀的SRM模式對目標(biāo)化合物進(jìn)行確證需要至少兩個碎片離子，質(zhì)譜儀屬于高分辨質(zhì)譜儀，因此，僅需要一個高分辨母離子和一個高分辨子離子就可以滿足對目標(biāo)化合物的確證要求。在本研究中，將全掃描模式的母離子作為定量離子，將峰豐度最高的HCD數(shù)據(jù)依賴性掃描碎片離子作為定性離子，并與理論值進(jìn)行了對照，見表3。

本研究采用電噴霧離子源正離子模式，通過總離子流掃描可以看出，3種原多甲藻酸貝類毒素形成的準(zhǔn)分子離子峰中[M＋H]＋峰豐度最高。采用HCD數(shù)據(jù)依賴性掃描得到多個碎片離子，形成的碎片離子中[M＋H－H2O]＋的響應(yīng)最高，因此選作為定性離子，見圖3。

表3 AZA-1、AZA-2和AZA-3的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 3 UPLC-MS/MS parameters of AZAs-1, 2 and 3

圖3 扇貝樣品中添加水平為10 ?g/kg的3種AZAs參考二級質(zhì)譜圖Fig.3 MS2fragmentation of 3 AZAs in scallops at spiked level of 10 ?g/kg

2.6 線性范圍、測定低限

3種原多甲藻酸貝類毒素采用基質(zhì)曲線-外標(biāo)法進(jìn)行定量。用空白樣品提取液配制質(zhì)量濃度為10～500 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/kg）和定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸計算，所得相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。根據(jù)10倍信噪比（RSN）確定化合物定量限（LOQ）。樣品中3種原多甲藻酸貝類毒素的LOQs均為10 μg/kg，表4列出了線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和LOQs。

表4 扇貝中AZAs的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和LOQsTable 4 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients and LOQs for 3 AZAs spiked in scallops

2.7 精密度和回收率

經(jīng)查閱，歐盟確立雙殼軟體動物中AZAs的最大允許限量為160 μg/kg[9]，實(shí)驗(yàn)選用不含上述3種毒素的貝類產(chǎn)品及其制品為空白樣品，分3個水平進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，每個添加水平進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分析并測定其精密度及回收率。3種AZAs在3個水平的添加回收率范圍均在76%～103%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%（n=6），滿足分析的要求，見表5。

表5 混合貝類樣品基質(zhì)中3種AZAs的回收率和精密度（n =6）Table 5 Recovery ranges and precision of 3 AZAs in mixed shellfish matrixes (n = 6)

2.8 實(shí)際樣品測定

表6 17份樣品測定結(jié)果Table 6 Results obtained by the established method for the determination of AZAs in 17 samples μg/kg

采用研究建立的方法對共17份市售和進(jìn)口貝類產(chǎn)品及其制品進(jìn)行了測定，其中3份樣品檢出了AZAs，其中有一份樣本同時檢出了AZA-1和AZA-2，另外兩份只檢出AZA-1，但均未超過歐盟制定的安全限量標(biāo)準(zhǔn)，見表6。

3 3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，通過改進(jìn)QuEChERS技術(shù)和基質(zhì)分散固相萃取凈化技術(shù)可有效去除基質(zhì)中的各類雜質(zhì)，消除干擾，采用超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜測定貽貝、牡蠣、蚌類、扇貝等食用貝類及其制品中3種原多甲藻酸貝類毒素具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便等特點(diǎn)，本方法的測定低限能夠滿足國際上對該類項(xiàng)目的限量要求，適用于分析和測定食用貝類及其制品中原多甲藻酸類貝類毒素。

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Rapid Profiling and Confirmation of Azaspiracids in Edible Shellfishes by Ultra High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry

HAN Shen, LIU Xin, LI Jian-hui, WANG Pei-yue, GU Jin, ZHANG Zhao-hui*
(Testing Center, Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China)

An ultra high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometric method (UHPLC-LTQ/ Orbitrap) was developed for the rapid profiling and confirmation of 3 natural azaspiracids (AZAs) (AZA-1, AZA-2 and AZA-3) in edible shellfishes including mussels, oysters, clams and scallops as well as related products. Samples were homogeneously extracted with acetonitrile-water. The diluted supernatants were then purif ed with a modif ed QuEChERS method. The separation was performed on an Acquity HSS T3 column (150 mm × 2.1 mm, 1.8 μm) by gradient elution with acetonitrile in water containing 5 mmol/L ammonium acetate and 0.1% formic acid. The high-resolution mass spectrometry was carried out by means of electrospray ionization in positive ion mode (ESI＋). The AZAs were detected by high-resolution MS under full scan and data-dependent scan modes, respectively. The limits of quantif cation (LOQ, RSN> 10) were 10 μg/kg for all the 3 AZAs. The calibration curves showed good linearity within the concentration range of 10 μg/L to 500 μg/L with correlation coeff cients (R2) more than 0.99. Shellf sh samples from home and abroad were prof led and conf rmed by the established method. AZAs were found in some samples. Therefore this method is easy, sensitive, reproducible and eff cient, and can be applied to prof le and conf rm AZAs in edible shellf shes and related products.

azaspiracids shellf sh toxins; high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry; QuEChERS

O657.6

A

1002-6630（2014）04-0116-06

10.7506/spkx1002-6630-201404024

2013-03-25

國家質(zhì)檢總局科技計劃項(xiàng)目（2011IK193；2012IK145）；國家質(zhì)檢總局質(zhì)檢行業(yè)公益性科研專項(xiàng)（201210029）

韓深（1981—），男，工程師，本科，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。E-mail：hansh@bjciq.gov.cn

*通信作者：張朝暉（1968—），男，高級工程師，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。E-mail：zhangzhh@bjciq.gov.cn