陳 磊，郭玉蓉，劉永峰*，米瑞芳，竇 嬌

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062）

5-氨基乙酰丙酸對(duì)蘋(píng)果幼果多酚含量、苯丙氨酸解氨酶活性及其基因表達(dá)的影響

陳 磊，郭玉蓉，劉永峰*，米瑞芳，竇 嬌

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062）

探究5-氨基乙酰丙酸（aminolevulinic acid，ALA）處理對(duì)蘋(píng)果幼果酚類(lèi)物質(zhì)、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanin ammonia-lyase，PAL）活性及其基因表達(dá)量的影響。在蘋(píng)果疏果期前，利用不同質(zhì)量濃度ALA處理蘋(píng)果幼果，采用紫外分光光度法測(cè)定ALA處理后12 d內(nèi)蘋(píng)果多酚和PAL活性，利用熒光定量法測(cè)定蘋(píng)果幼果PAL基因表達(dá)量。結(jié)果表明：ALA處理質(zhì)量濃度在300 mg/L以?xún)?nèi)，隨著質(zhì)量濃度提高，蘋(píng)果多酚含量、PAL酶活性及其基因表達(dá)量均升高，到400 mg/L時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)；相同質(zhì)量濃度ALA處理蘋(píng)果幼果后，幼果的上述3 項(xiàng)指標(biāo)均隨時(shí)間延長(zhǎng)而明顯提高，在第9天時(shí)達(dá)到最高值，12 d后開(kāi)始下降。為提高蘋(píng)果疏果多酚含量，實(shí)現(xiàn)疏果的最大利用率，生產(chǎn)中需要選擇適宜的ALA處理濃度和時(shí)間采集幼果。

蘋(píng)果幼果；多酚；苯丙氨酸解氨酶；基因表達(dá)

多酚類(lèi)物質(zhì)是蘋(píng)果果實(shí)重要功能成分之一，具有抑菌、抗過(guò)敏、抗衰老、清除自由基、抗氧化等多種功能[1]。據(jù)報(bào)道蘋(píng)果幼果多酚含量是成熟果的10 倍，含量高達(dá)110～357 mg/100 g新鮮幼果[2]。而蘋(píng)果疏果工作是解決座果過(guò)量、克服大小年、提高果品質(zhì)量、實(shí)現(xiàn)持續(xù)均衡豐產(chǎn)的必要技術(shù)措施。在中國(guó)每年有約160萬(wàn)t的蘋(píng)果疏果腐爛在果園里，造成資源的大量浪費(fèi)[3]。因此，從蘋(píng)果幼果中提取蘋(píng)果多酚對(duì)于充分利用蘋(píng)果疏果資源具有重要意義。

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）不僅是生物體內(nèi)合成卟啉化合物的第一個(gè)關(guān)鍵前體[4]，還參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)過(guò)程。低質(zhì)量濃度ALA（＜500 mg/L）能通過(guò)刺激苯丙烷代謝系統(tǒng)而提高植物多酚含量[5-6]，也可以增強(qiáng)植物抗逆性[7]。苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-1yase，PAL）普遍存在于高等植物中，是苯丙烷類(lèi)代謝的關(guān)鍵酶[8]。相關(guān)報(bào)道指出PAL活性不僅與植物多酚含量成正比[9]，還與植物果實(shí)著色[10]、褐變[11-12]及抗逆性[13-14]等密切相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)ALA處理蘋(píng)果疏果期前期的幼果，研究蘋(píng)果幼果多酚含量的變化與PAL活性的關(guān)系，從影響蘋(píng)果PAL基因表達(dá)層面探究蘋(píng)果幼果多酚的變化規(guī)律，從而提高蘋(píng)果疏果中多酚的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇陜西省咸陽(yáng)市禮泉縣蘋(píng)果綜合實(shí)驗(yàn)站的10年生“長(zhǎng)富2號(hào)”蘋(píng)果樹(shù)，在蘋(píng)果疏果期前20 d（2013年4月15 日），挑選5 株10 年生、樹(shù)勢(shì)接近的果樹(shù)作為實(shí)驗(yàn)樹(shù)。分別用質(zhì)量濃度為100、200、300、400 mg/L的ALA噴灑幼果，噴灑處理后3、6、9、12 d采摘幼果，每株實(shí)驗(yàn)樹(shù)（其中1株為對(duì)照）每次取幼果20 個(gè)，6 個(gè)新鮮幼果用來(lái)測(cè)定多酚，6 個(gè)新鮮幼果用來(lái)測(cè)定PAL酶活性，剩余8 個(gè)幼果經(jīng)液氮速凍后置于－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

StepOne RT-PCR儀 美國(guó)ABI公司；RT-PCR試劑盒 南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和熒光染料SYBR 日本TaKaRa公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

UNICO PC2102型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司；TGL-16G高速低溫離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.3 幼果總多酚含量的測(cè)定

參照任文霞等[15]的方法。蒸餾水洗凈6 個(gè)新鮮幼果，濾紙吸干表面水分，粉碎后取1.0 g幼果果肉，加入20 mL 70%乙醇，55 ℃超聲輔助提取4次，定容至100 mL。取1.0 mL提取液加入12 mL飽和NaCO3和1.0 mL福林酚，定容至25 mL。避光反應(yīng)1 h后，檢測(cè)OD765nm值，多酚含量直接用OD765nm表示。

1.4 PAL酶活力的測(cè)定

參照林植芳等[16]的方法。蒸餾水洗凈6個(gè)新鮮幼果，用濾紙吸干表面水分，粉碎后取0.5 g幼果果肉，加入5 mL 0.05 mol/L pH 8.8的硼酸緩沖液（含0.005 mol/L β-巰基乙醇），然后加入0.1 g 聚乙烯吡咯烷酮和少許石英砂，冰浴下研磨成勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清液為酶液，用來(lái)測(cè)定酶活力。

酶活力測(cè)定反應(yīng)體系：0.02 mol/L L-苯丙氨酸（用0.1 mol/L、pH 8.8的硼酸緩沖液配制）1.0 mL，0.05 mol/L硼酸緩沖液2.0 mL，1.0 mL酶液，30 ℃水浴30 min，測(cè)定OD290nm值。每克鮮質(zhì)量每分鐘所引起吸光度變化 0.00l為1個(gè)酶活力單位（U/（min·g））[17]。

1.5 提取蘋(píng)果果實(shí)總RNA及其反轉(zhuǎn)錄

取凍存的蘋(píng)果幼果，采用改良的CTAB-LiCl法[18]提取蘋(píng)果幼果總RNA，用微量紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA的濃度及純度進(jìn)行檢測(cè)。利用TaKaRa公司提供的cDNA試劑盒將不同濃度處理及不同時(shí)間點(diǎn)的蘋(píng)果幼果總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，并將質(zhì)量濃度統(tǒng)一稀釋至50 ng/mL。

1.6 基因表達(dá)分析

蘋(píng)果PAL基因引物參照Harb等[19]的引物序列，以蘋(píng)果管家基因β-actin為內(nèi)參，引物序列如表1所示，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。熒光定量PCR以SYBR為熒光染料，采用20 ?L體系，包括：10.0 ?L SYBR?Premix Ex TaqTM（2×)反應(yīng)液、0.4 ?L RcxDag（2×）、上下游引物各0.8 ?L、cDNA模版2 ?L、加ddH2O補(bǔ)至20 ?L。混勻、離心，放入PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)中設(shè)置空白對(duì)照，使用雙蒸水為模版，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。反應(yīng)結(jié)束后記錄Ct值，采用2－△△Ct法[20]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 熒光定量引物序列Table1 Sequences of primers targeting PLA and b-actin used for quantitative RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 幼果總多酚含量的變化

圖1 不同質(zhì)量濃度ALA對(duì)蘋(píng)果幼果總酚含量的影響Fig.1 Impact of different concentrations of ALA on total phenol content in young apple fruit

由圖1可知，300 mg/L以?xún)?nèi)總酚含量隨ALA質(zhì)量濃度升高而升高，400 mg/L時(shí)總酚含量開(kāi)始有所下降，300 mg/L為最佳處理質(zhì)量濃度。在不同處理時(shí)間條件下，蘋(píng)果幼果總酚含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而升高，處理后12 d達(dá)到最佳。

在不同處理質(zhì)量濃度不同處理時(shí)間條件下，相同處理時(shí)間內(nèi)不同質(zhì)量濃度ALA處理幼果后，前9 d蘋(píng)果幼果總酚含量表現(xiàn)出增長(zhǎng)趨勢(shì)；第12天時(shí)，除300 mg/L外，其余組多酚質(zhì)量濃度均開(kāi)始下降；前9 d同一質(zhì)量濃度不同處理時(shí)間總酚的含量也表現(xiàn)出顯著性差異，第12天時(shí)除300 mg/L外，其余組則無(wú)顯著性差異，尤其是在300 mg/L時(shí)，多酚含量增長(zhǎng)速率最快（第6天時(shí)最高比對(duì)照高出33.33%），其含量在12 d時(shí)達(dá)到最高，比對(duì)照組高14.29%。ALA處理幼果后，蘋(píng)果幼果總酚含量總體上表現(xiàn)出增長(zhǎng)趨勢(shì)，并在A(yíng)LA質(zhì)量濃度為300 mg/L處理第9天時(shí)表現(xiàn)出最佳，這與汪良駒等[21]的研究結(jié)果相同。

2.2 PAL酶活力測(cè)定

表2 不同質(zhì)量濃度ALA對(duì)蘋(píng)果幼果PAL活性的影響Table2 Impact of different concentrations of ALA on PAL activity in young apple fruit

由表2可知，在不同ALA質(zhì)量濃度條件下，PAL活性變化不顯著，但在300 mg/L時(shí)PAL活性表現(xiàn)出最大。幼果處理后，隨著處理時(shí)間的變化，PAL活性有顯著性變化，其中第9天酶活力最高，12d時(shí)活力開(kāi)始降低。從時(shí)間上來(lái)看，處理后9 d以前PAL活性在任意質(zhì)量濃度下均表現(xiàn)出升高趨勢(shì)，并在第9天各質(zhì)量濃度的酶活力均達(dá)到最大，處理后第12天時(shí)酶活力均開(kāi)始顯著下降；從ALA不同質(zhì)量濃度上來(lái)說(shuō)：300 mg/L以下酶活力均表現(xiàn)出上升趨勢(shì)，到300 mg/L時(shí)酶活力均達(dá)到最大，400 mg/L時(shí)酶活力開(kāi)始降低。ALA處理后PAL活性總體上表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，并在300 mg/L 時(shí)表現(xiàn)出最大增長(zhǎng)趨勢(shì)且最高（第9天）和最低（第3天）相比增幅達(dá)到92.68%，這與Xie li等[22]的研究結(jié)果相同。

2.3 PAL基因熒光定量檢測(cè)

用熒光定量方法研究了蘋(píng)果幼果體內(nèi)PAL基因在不同處理時(shí)間、ALA不同質(zhì)量濃度條件下表達(dá)量的變化。

由圖2可知，ALA質(zhì)量濃度在300 mg/L以前，PAL基因表達(dá)變化不大；質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)PAL基因表現(xiàn)出最大表達(dá)量；400 mg/L時(shí)PAL基因表達(dá)量開(kāi)始有所下降，但總體上表現(xiàn)為上調(diào)趨勢(shì)。在不同處理時(shí)間條件下，PAL基因表達(dá)量在處理后3～6 d期間表達(dá)量變化顯著，6～9 d變化不大，第9天時(shí)表達(dá)量最高，12 d時(shí)表達(dá)量開(kāi)始降低。在不同處理質(zhì)量濃度不同處理時(shí)間條件下，不同質(zhì)量濃度處理9 d以前，PAL基因相對(duì)表達(dá)量均有所上升；而在第12 天時(shí)，表達(dá)量又相對(duì)下降。300 mg/L和400 mg/L處理時(shí)PAL基因表達(dá)量波動(dòng)較大，特別是300 mg/L處理后第9天與第12天相比，該基因上調(diào)表達(dá)是對(duì)照的2.64倍。因此，ALA處理蘋(píng)果幼果的最佳質(zhì)量濃度為300 mg/L，最佳采集幼果時(shí)間為噴灑后9 d。

圖2 各處理PAL基因表達(dá)變化量Fig.2 Impact of different concentrations of ALA on PAL gene expression in young apple fruit

3 結(jié)論與討論

不同質(zhì)量濃度ALA處理幼果后，蘋(píng)果幼果體內(nèi)多酚含量、PAL活性及其基因表達(dá)量均變化顯著，且呈現(xiàn)出類(lèi)似的規(guī)律，即質(zhì)量濃度從100～300 mg/L期間各項(xiàng)指標(biāo)均明顯遞增，400 mg/L時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)。蘋(píng)果幼果多酚總體上表現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)，并在300 mg/L處理組第9天達(dá)到最大。不同質(zhì)量濃度ALA對(duì)幼果的各項(xiàng)指標(biāo)作用表現(xiàn)出先增后減的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象可再次證明ALA在低質(zhì)量濃度下能夠促進(jìn)植物代謝，高質(zhì)量濃度會(huì)抑制植物代謝[23]。同一質(zhì)量濃度不同時(shí)間內(nèi)ALA處理幼果后，幼果體內(nèi)多酚、PAL活性及其基因表達(dá)量在3～9d內(nèi)遞增；第12天時(shí)PAL酶活力及其基因表達(dá)量與第9天相比時(shí)均表現(xiàn)出大幅度下降，而多酚含量變化不大，這是由于幼果體內(nèi)多酚積累，但其遞增速率明顯下降。上述現(xiàn)象可能是因?yàn)锳LA被完全吸收或損耗，不能持續(xù)刺激苯丙烷代謝系統(tǒng)。這一現(xiàn)象說(shuō)明ALA的最佳效果期為處理后6～9 d。因此建議在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中，盡量在疏果期前6～9d，選用300 mg/L的ALA處理幼果，才能達(dá)到疏果中多酚的最大含量。

另外，隨著ALA處理質(zhì)量濃度的增加，幼果多酚的變化規(guī)律、PAL酶活性變化規(guī)律和PAL基因表達(dá)變化規(guī)律三者相吻合這一現(xiàn)象，也與前人的研究規(guī)律相同[3-4,19]，并再次驗(yàn)證了“基因控制酶的合成，酶控制產(chǎn)物的合成”這一生物學(xué)規(guī)律。ALA刺激了蘋(píng)果體內(nèi)苯丙烷代謝途徑，增加關(guān)鍵酶PAL的基因表達(dá)量，進(jìn)而提高PAL酶活性，調(diào)控酚類(lèi)物質(zhì)的代謝，促進(jìn)多酚物質(zhì)的生物合成[24]。

ALA的處理質(zhì)量濃度在300 mg/L以?xún)?nèi)，隨著質(zhì)量濃度提高，PAL酶活性與多酚含量、相對(duì)基因表達(dá)量均升高，到400 mg/L時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)；ALA處理后3 項(xiàng)指標(biāo)明顯提高，并在處理后第9天達(dá)到最高值，12 d開(kāi)始下降。在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中，為提高蘋(píng)果幼果中多酚的提取率，盡量在疏果期前6～9 d，選用300 mg/L的ALA處理幼果，才能達(dá)到疏果中多酚的最大含量，實(shí)現(xiàn)利用蘋(píng)果疏果提取多酚的最佳效果。

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Effect of 5-Aminolevulinic Acid on Polyphenol Content, PAL Activity and PAL Gene Expression in Young Apple Fruits

CHEN Lei, GUO Yu-rong, LIU Yong-feng*, MI Rui-fang, DOU Jiao
(College of Food Engineering and Nutritional Sciences, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

The purpose of this study was to find out the effect of 5-aminolevulinic acid (ALA) application on phenolic substances and phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity and PAL gene expression in young apple fruits. Apple fruits were treated with various concentrations of ALA before thinning, and then over a subsequent period of 12 days, total phenolic contents and PAL activity were measured by UV spectrophotometry and the expression of PAL gene by fluorescent quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The experiment results indicated that as the ALA concentration increased up to 300 mg/L, the PAL activity, total phenolic content and PAL gene expression levels all showed an increasing trend, while the opposite pattern was observed for these three parameters when the ALA concentration was further raised to 400 mg/L. At identical ALA concentrations, all these parameters became significantly higher with prolonged treatment time, reaching the maximum levels on the 9thday, and began to fall on the 12thday. Thus, it can be concluded that treatment of young apple fruits with ALA at concentrations around 300 mg/L may result in a variety of desired physiological changes, such as markedly increasing phenolic substances and improving the activity level and gene expression of PAL.

young apple fruits; polyphenols; phenylalanine ammonia lyase; gene expression

S131.1

A

1002-6630（2014）11-0135-04

10.7506/spkx1002-6630-201411027

2013-07-11

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（蘋(píng)果）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-28蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)體系）

陳磊（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與食品貯藏。E-mail：chen122148@163.com

*通信作者：劉永峰（1981—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)及營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：yongfen200@126.com