劉麗莎，陶國琴，郭 宏，呂曉蓮，賈建會，彭義交

（1.北京市食品研究所，北京 100162；2.北京食品科學研究院，北京 100068；3.北京二商集團有限責任公司，北京 100053）

響應面法優(yōu)化豆乳鏈球菌增殖培養(yǎng)基

劉麗莎1,2，陶國琴2，郭 宏1,2，呂曉蓮3，賈建會1,2，彭義交1,2

（1.北京市食品研究所，北京 100162；2.北京食品科學研究院，北京 100068；3.北京二商集團有限責任公司，北京 100053）

針對優(yōu)良酸豆乳發(fā)酵菌株豆乳鏈球菌（Streptococcus sojalactis）SY1.1增殖培養(yǎng)基進行優(yōu)化，研究碳氮源對豆乳鏈球菌生長的影響，并采用響應面法優(yōu)化豆乳鏈球菌SY1.1的增殖培養(yǎng)基配方。結果表明：以AST為基礎培養(yǎng)基，優(yōu)選大豆蛋白胨和蔗糖為最適氮源和碳源，質量比為1∶2，采用Plackett-Burman設計對11 種促乳酸菌生長因子進行評價，利用中心旋轉組合設計和響應面分析確定增殖培養(yǎng)基的配方為：蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨20 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、番茄汁85.8 mL/L、胡蘿卜汁109 mL/L、玉米漿6 g/L，pH 6.8。SY1.1以接種量2%，在37℃培養(yǎng)12h時，活菌數可達（8.9±0.2）×108CFU/mL，較初始豆?jié){培養(yǎng)基的活菌數（1.03×108CFU/mL）提高了7.64 倍。

豆乳鏈球菌；增殖培養(yǎng)基；Plackett-Burman設計；響應面法優(yōu)化

酸豆奶是以大豆為原料，經乳酸菌發(fā)酵制成的乳狀食、飲兩棲型產品。微生物作用能消除大豆的抗營養(yǎng)因子和有害物質[1-2]，產生多種多肽、氨基酸和具有香味的有機酸、醇、酯[3]，還具有抗腫瘤、抗氧化、降低膽固醇等保健功能[4]。此外大豆不含膽固醇和乳糖，是一種優(yōu)質植物蛋白發(fā)酵原料[5]。

目前對酸豆乳發(fā)酵工藝研究較多，研究人員利用乳酸乳球菌[6]、嗜熱鏈球菌[7]、干酪乳桿菌[8]、雙歧桿菌[9]等發(fā)酵酸豆乳。但乳酸菌在豆乳中的生長不及牛乳，存在發(fā)酵風味不佳、乳清析出和質地粗糙等問題[10]，開發(fā)酸豆乳優(yōu)良菌株及發(fā)酵劑非常重要。本項目組從豆?jié){中分離到天然菌株——豆乳鏈球菌（Streptococcus sojalactis）SY1.1，產酸快，凝乳時間小于3 h，產生濃郁的酸豆乳清香，是理想的酸豆乳發(fā)酵菌種。優(yōu)良的發(fā)酵劑增殖培養(yǎng)基是制備發(fā)酵劑的前提，應具備以下特點：目標菌株生長良好、菌體易分離、成本低廉。研究證明Plackett-Burman試驗和響應面設計相結合可篩選適合菌株增殖的因素，建立連續(xù)變量曲面模型，研究各因素水平及交互作用的影響，能大幅降低勞動強度縮短實驗時間，已應用于不同種類培養(yǎng)基成分的快速篩選及復配[11]。

本實驗對適合豆乳鏈球菌增殖的基礎培養(yǎng)基進行篩選，優(yōu)化其碳源和氮源，并采用Plackett-Burman設計和響應面法篩選優(yōu)化豆乳鏈球菌的生長強化因子[12]，提高菌體密度，為酸豆乳發(fā)酵劑的開發(fā)提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

菌種：豆乳鏈球菌（Streptococcus sojalactis）SY1.1，分離自中國傳統(tǒng)食品豆?jié){，由北京市食品研究所食品微生物學實驗室選育保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

豆?jié){培養(yǎng)基：大豆→清洗→浸泡（10 h）→打漿（豆、水質量比1∶8）→過濾→滅菌（115 ℃、10 min），用于豆乳鏈球菌菌種活化。

TJA固體培養(yǎng)基[13]：用于豆乳鏈球菌活菌計數。

TSB培養(yǎng)基、基礎培養(yǎng)基、AST培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、MSA培養(yǎng)基按《微生物培養(yǎng)基的制造與應用》[14]配制。

番茄汁、胡蘿卜汁和玉米汁：市售新鮮番茄、胡蘿卜和玉米→清洗→熱燙（90～95 ℃、3 min）→榨汁→過濾→調配（1 kg果蔬調配成2 L果汁）→滅菌備用。

1.1.3 試劑

葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米漿 北京藍弋化工產品有限責任公司；牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、酪蛋白 北京奧博星生物技術有限公司。

1.1.4 儀器設備

SCL-1300型垂直流潔凈工作臺 北京賽伯樂實驗儀器有限公司；PHS-25型酸度計（數顯） 上海精密科學儀器有限公司；722型可見分光光度計 上海光譜儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

將SY1.1接種于豆?jié){培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至凝乳，傳代活化3 次至菌種活力恢復至3.5 h內凝乳。

1.2.2 活菌數測定

采用傾注平板TJA平板法，37 ℃培養(yǎng)48 h計數。

1.2.3 生物量測定

采用分光光度計于波長600 nm處測定菌液OD600nm，以相應未接菌培養(yǎng)液為空白對照。

1.2.4 SY1.1生長基礎培養(yǎng)基的確定

豆乳鏈球菌SY1.1活化后以 2%（約106CFU/mL）接種量分別接入適合乳酸菌增殖的培養(yǎng)基（MRS、AST、M17、TSB、MSA和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基）中，于37 ℃培養(yǎng)12 h，測定增殖期間生物量（OD600nm）的變化，選擇最適的基礎培養(yǎng)基。

1.2.5 碳源對SY1.1增殖的影響

在AST中以葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖等分別替代碳源（質量濃度10 g/L），接種2%（約106CFU/mL）SY1.1，于37 ℃培養(yǎng)12 h，測定生物量（OD600nm）變化，研究不同碳源對豆乳鏈球菌生長的影響。

1.2.6 氮源對SY1.1增殖的影響

在基礎培養(yǎng)基中按相同含氮量（1.7 g/L）以多價胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏和酪蛋白胨，替代AST中氮源，接種2%（約106CFU/mL）SY1.1，于37 ℃培養(yǎng)12 h，研究不同氮源對豆乳鏈球菌生長的影響。

1.2.7 碳氮比對SY1.1增殖的影響

按碳氮質量比1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3配制不同培養(yǎng)基，接種2%（約106CFU/mL）SY1.1，于37 ℃培養(yǎng)12 h，研究碳氮比對豆乳鏈球菌生長的影響。

1.2.8 Plackett-Burman試驗研究生長因子對SY1.1增殖的影響

根據相關文獻[15-19]報道的能促進乳酸菌增殖的生長因子，在培養(yǎng)基中添加11種生長因子：番茄汁（0～100 mL/L）、胡蘿卜汁（0～100 mL/L）、玉米汁（0～100 mL/L）、啤酒汁（0～100 mL/L）、玉米漿（0～50 g/L）、蜂蜜（0～10 g/L）、硫酸鎂（0～0.2 g/L）、硫酸錳（0～0.15 g/L）、氯化鈣（0～0.2 g/L）、硫酸亞鐵（0～0.1 g/L）、吐溫-80（0～1 mL/L）。采用Plackett-Burman設計篩選豆乳鏈球菌SY1.1生長強化因子，試驗設計及數據分析等采用Design Expert軟件完成。

1.2.9 響應面法優(yōu)化生長因子添加量

篩選出影響豆乳鏈球菌SY1.1增殖的關鍵影響因素，采用旋轉中心組合設計（Central Composite Rotatable Design，CCRD）法，優(yōu)化該菌增殖的最佳培養(yǎng)基配方。試驗設計及數據分析等采用Design Expert軟件完成。

2 結果與分析

2.1 SY1.1生長基礎培養(yǎng)基的確定

對幾種適合于乳酸菌增殖的培養(yǎng)基進行研究，豆乳鏈球菌的增殖情況如圖1所示。

圖1 菌株SY1.1基礎培養(yǎng)基篩選Fig.1 Screening of basic medium for strain SY1.1

以OD600nm為指標考察SY1.1在6種培養(yǎng)基中的增殖情況，由圖1可知，菌株SY1.1在AST培養(yǎng)基中生長良好，顯著高于MRS培養(yǎng)基（P＜0.01）。AST培養(yǎng)基成分較簡單、配制方便、溶液澄清無沉淀，便于在后期進行菌體富集濃縮，因此選擇AST培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基進行優(yōu)化。

2.2 碳源對SY1.1增殖的影響

以AST培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，以葡萄糖、乳糖、淀粉分別替代蔗糖，豆乳鏈球菌培養(yǎng)12h后的增殖情況如圖2所示。

圖2 碳源對菌株SY1.1增殖的影響Fig.2 Screening of carbon source for strain SY1.1

由圖2可知，菌株SY1.1可以代謝葡萄糖、乳糖、蔗糖進行增殖，其中蔗糖的效果最佳，因此將蔗糖作為SY1.1增殖培養(yǎng)基的碳源。

2.3 氮源對SY1.1增殖的影響

在AST中分別添加8種有機氮源替代AST中氮源，豆乳鏈球菌培養(yǎng)12h后的增殖情況如圖3所示。

圖3 氮源對菌株SY1.1增殖的影響Fig.3 Screening of nitrogen source for strain SY1.1

由圖3可知，大豆蛋白胨和酵母浸粉較AST培養(yǎng)基能夠顯著提高豆乳鏈球菌的增殖（P＜0.01），大豆蛋白胨效果最佳，其余氮源的增殖效果較差，其中酪蛋白胨不能作為氮源被豆乳鏈球菌利用。豆乳鏈球菌SY1.1分離自傳統(tǒng)豆?jié){中，大豆蛋白胨的氨基酸組成可能更接近SY1.1原生長環(huán)境——豆?jié){，適合豆乳鏈球菌的增殖。因此，選擇大豆蛋白胨作為豆乳鏈球菌SY1.1的氮源。

2.4 碳氮比對SY1.1增殖的影響

改變蔗糖和大豆蛋白胨的添加比例（質量百分比），豆乳鏈球菌培養(yǎng)12 h后的增殖情況如圖4所示。碳氮比對菌株生長有重要作用，直接影響其生長和發(fā)酵產物的積累。有報道表明碳氮比在2～0.5時，菌體生長情況良好，菌體密度較高[19]。當碳氮比小于1∶2時，豆乳鏈球菌的生物量隨碳氮比增高而增加，超過1∶2后，豆乳鏈球菌的生物量保持相對穩(wěn)定，無明顯的增長。因此，將培養(yǎng)基中碳氮比確定為1∶2。

圖4 碳氮比對菌株SY1.1增殖的影響Fig.4 Screening of C/N ratio for strain SY1.1

2.5 影響豆乳鏈球菌SY1.1增殖的關鍵生長因子的確定

通過Plackett-Burman試驗（結果未列出）從11 種已報道的乳酸菌生長因子中篩選出影響豆乳鏈球菌SY1.1增殖的關鍵生長因子。番茄汁（P=0.030 8）、胡蘿卜汁（P= 0.034 1）和玉米漿（P=0.012 7）在95%概率水平差異顯著，其余因子均不顯著，因此選擇番茄汁、胡蘿卜汁和玉米漿作為豆乳鏈球菌SY1.1的生長強化因子，通過響應面優(yōu)化進一步考察對SY1.1增殖的影響。乳酸菌是生長因子異養(yǎng)型微生物，需要額外提供維生素等多種生長因子，保證菌株的正常代謝，促進其生長。研究表明，多種果蔬汁可促進乳酸菌的生長，番茄汁和胡蘿卜汁含有豐富的維生素和礦物質離子，能滿足乳酸菌對營養(yǎng)的需求[20]。

2.6 響應面分析優(yōu)化SY1.1增殖培養(yǎng)基

通過Plackett-Burman設計選出SY1.1的關鍵生長因子：番茄汁、胡蘿卜汁和玉米漿，按三因素三水平旋轉中心組合設計添加至優(yōu)化后的基礎培養(yǎng)基，試驗設計及結果如表1所示。

表1 旋轉中心組合設計及結果Table1 CCRD design with experimental and predicted cell population of SY1.1

Box-Behnken設計數據采用Design Expert 8.0.7.1軟件響應面分析程序進行二次多項回歸擬合，獲得3種關鍵生長因子與菌體的二次多項式回歸模型方程：

Y=85.80－3.14A＋3.86B＋2.00C－5.00AB－1.75AC＋2.08BC－7.41A2－15.26B2－13.67C2

由該方程得到的預測值如表1所示，二次回歸方程及各項方差分析結果如表2所示。

表2 活菌數二次多項模型及各項的方差分析Table2 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

由表2方差分析結果可知，模型P＜0.000 1表明模型極顯著，失擬項P=0.108＞0.05，在α=0.05水平上不顯著；相關系數R2=0.979 7，表明模型相關性良好；=0.980 2，表明98%的響應面變化可以通過該模型解釋，與實際情況擬合良好，可用于SY1.1的生長增殖情況預測。

圖5 各因素及其相互作用對SY1.1活菌數影響的響應面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effect of medium components on the growth of SY1.1

除AC項外，其余因素對SY1.1活菌數的影響均顯著，AB、BC交互影響顯著，AC交互作用不顯著。由二次多項方程得到的響應面三維立體圖及等高線圖如圖5所示，直接反映出各因素及其交互作用對響應值的影響，等高線稀疏顯示響應面曲面圖的平陡。

SY1.1的活菌數在各因素設定范圍內都有最大值，采用Optimization對模型求導得出極值點，當各因素添加量為番茄汁8.58 mL/100mL、胡蘿卜汁10.90 mL/100mL、玉米漿0.60 g/100mL時，模型預測最大響應值為8.7×108CFU/mL。在上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，按2%接種SY1.1，37℃培養(yǎng)12 h，SY1.1實際活菌數為（8.9±0.2）×108CFU/mL，可見該模型能較好預測SY1.1的菌體生長情況。

3 結 論

本實驗通過Plackett-Burman設計從11種生長強化因子中篩選出番茄汁、胡蘿卜汁和玉米漿為影響SY1.1增殖的關鍵因素。通過響應面法獲得適合豆乳鏈球菌SY1.1增殖的最佳培養(yǎng)基：蔗糖1 g/100 mL、大豆蛋白胨2 g/100 mL、磷酸氫二鉀0.2 g/100 mL、番茄汁8.58 mL/100 mL、胡蘿卜汁10.90 mL/100 mL、玉米漿0.60 g/100 mL，pH 6.8。豆乳鏈球菌在此培養(yǎng)基中經37 ℃培養(yǎng)12 h，活菌數達（8.9±0.2）×108CFU/mL，比優(yōu)化前（1.03×108CFU/mL）提高了近7.64 倍，且培養(yǎng)基黏度較小、無沉淀、菌體易分離，為開發(fā)直投式酸豆乳發(fā)酵劑提供了理論參考。

在后續(xù)實驗中，還需對SY1.1培養(yǎng)條件及方式進行研究，如采用分批補料培養(yǎng)、細胞循環(huán)培養(yǎng)等方式[21-22]進一步提高活菌數，并對其冷凍干燥工藝及保護劑進行研究，以獲得高密度菌體，完成酸豆乳直投式發(fā)酵劑的制備工藝。

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Optimization of Culture Medium for Streptococcus sojalactis SY1.1 Using Response Surf ace Methodology

LIU Li-sha1,2, TAO Guo-qin2, GUO Hong1,2, Lü Xiao-l ian3, JIA Jian-hui1,2, PENG Yi-jiao1,2
(1. Beijing Food Research Institute, Beijing 100162, China; 2. Beijing Academy of Food Sciences, Beijing 100068, China; 3. Beijing Er Shang Group Co. Ltd., Beijing 100053, China)

In this paper, response surface methodology was used to optimize the composition of AST-based culture medium for Streptococcus sojalactis SY1.1 to obtain high density of bacteria. Through single-factor experiments, the optimum carbon source and nitrogen source were found to be sucrose and soy peptone, respectively. The major medium components for SY1.1 were screened by Plackett-Burman design. Then, the optimum culture medium was determined to consist of 10 g/L sucrose, 20 g/L soy peptone, 2 g/L dipotassium phosphate, 85.8 mL/L tomato juice, 109 mL/L carrot juice and 6 g/L corn steep liquor at pH 6.8 by central composite design and response surface analysis. The cell production of SY1.1 cultured in the optimized medium for 12 h at 37 ℃ was (8.9±0.2) ×108CFU/mL, which was 8.64 times higher than that (1.03×108CFU/mL) observed with soymilk as initial medium.

Streptococcus sojalactis; optimum culture medium; Plackett-Burman; response surface optimization

TS214

A

1002-6630（2014）11-0124-05

10.7506/spkx1002-6630-201411025

2013-10-31

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD34B03）；北京市科技計劃項目（Z111100066111007）

劉麗莎（1989—），女，助理工程師，碩士，研究方向為乳酸菌發(fā)酵食品開發(fā)。E-mail：liulisha0616@sina.com