胡華剛，肖 璇，劉慧敏，孫婉娟，唐曉靜，樸香蘭，徐斯凡,*

(1. 中央民族大學(xué) 中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

人參莖葉總皂苷對(duì)幼年雄性大鼠生殖系統(tǒng)的影響及作用機(jī)制

胡華剛1，肖 璇2，劉慧敏1，孫婉娟1，唐曉靜1，樸香蘭1，徐斯凡1,*

(1. 中央民族大學(xué) 中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：研究人參莖葉總皂苷對(duì)幼年雄性大鼠生殖系統(tǒng)的影響及作用機(jī)制。方法：將40只SD幼年大鼠分為對(duì)照組及人參莖葉總皂苷低、中、高劑量給藥組，灌胃兩周后處死，用放射免疫法檢測(cè)大鼠血清中睪酮的含量，用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)量大鼠血清中雙氫睪酮、促黃體激素和促卵泡素的含量，稱(chēng)量大鼠的睪丸質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)量增加量、睪丸臟器系數(shù)和精子密度。用高效液相色譜儀對(duì)比分析高劑量組大鼠血清和對(duì)照組血清中成分的差異。將高劑量組大鼠血清和人參莖葉總皂苷溶液，按0%（對(duì)照組）、5%、10%、15%的體積分?jǐn)?shù)分別加到培養(yǎng)的大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，用臺(tái)盼藍(lán)染色法和噻唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞存活率和活力，用放免法檢測(cè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中睪酮的含量，用大鼠環(huán)磷酸腺苷酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷的變化。用SPSS軟件分析各組間差異。結(jié)果：人參莖葉總皂苷能劑量依賴(lài)性地顯著降低幼年大鼠的血清睪酮水平（P＜0.01）、雙氫睪酮（P＜0.01）水平和精子密度（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，高劑量組大鼠血清中含有5種成分是對(duì)照組中所沒(méi)有的，并且人參莖葉總皂苷給藥組的睪丸質(zhì)量（P＜0.05）和體質(zhì)量增加量（P＜0.01）顯著降低，血清促黃體激素（P＜0.01）、促卵泡素（P＜0.01）和睪丸臟器系數(shù)顯著上升（P＜0.05）。人參莖葉總皂苷及其含藥血清能抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)環(huán)磷酸腺苷水平和睪酮的合成。結(jié)論：人參莖葉總皂苷可能通過(guò)抑制蛋白激酶A途徑降低大鼠血清中睪酮的生成，從而抑制睪丸發(fā)育和精子生成，影響雄性幼鼠生殖系統(tǒng)的發(fā)育。

人參莖葉總皂苷；睪酮；精子；促黃體激素；促卵泡素

人參為五加科人參屬植物人參（Panax ginseng C. A. Mey.）的根，是名貴中藥，藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[1]。人參味甘、微苦、微溫，歸脾、肺、心、腎經(jīng)，能大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智，用于體虛欲脫、肢冷脈微、脾虛食少、肺虛喘咳、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、氣血虧虛、久病虛羸、驚悸失眠、陽(yáng)痿宮冷[2]。人參不僅是名貴藥材，2002年衛(wèi)生部將人參葉和人參列為保健食品；2012年國(guó)家衛(wèi)生部又將人參列為新資源食品，食用部位為根及根莖。

人參的主要功效成分為人參皂苷[3]，為了綜合利用人參的地上部分，人們于1976年開(kāi)始對(duì)人參莖葉的化學(xué)成分進(jìn)行了研究。人參莖葉總皂苷（total ginsenosides of ginseng stems and leaves，TGSL）是2010年版《中國(guó)藥典》新收載的品種[4]，由于其富含人參皂苷并具有顯著的生理活性，一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，但是人參莖葉總皂苷對(duì)雄性生殖的作用僅有數(shù)篇報(bào)道，也僅僅局限于腹腔注射人參莖葉總皂苷后對(duì)遺傳物質(zhì)保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究[5-10]。本實(shí)驗(yàn)用人參莖葉總皂苷灌胃幼年雄性大鼠研究其在整體情況下對(duì)生殖系統(tǒng)的影響，并應(yīng)用血清藥理學(xué)的方法研究其對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

出生6周的雄性SD幼年大鼠40只，（100±10）g；由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物飼養(yǎng)合格證號(hào)SCXK（軍）2007-004。大鼠維持飼料，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)（京飼審（2009）06166）。

TGSL，購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)HJ091201-Z，用人參皂苷作標(biāo)準(zhǔn)品，紫外分光光度儀檢測(cè)總皂苷含量為80.33%。

碘（I125）睪酮放射免疫分析藥盒（批號(hào)100720） 北京北方生物技術(shù)研究所；大鼠雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（FA02073B）、大鼠促黃體激素（luteinizing hormone，LH）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（FA02131B）、大鼠促卵泡素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（FA02107B）、大鼠環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（FA02090B） 上海滬峰生物科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；胎牛血清 美國(guó)Hyclone 公司；Ⅱ型膠原酶、噻唑藍(lán) 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XP205型分析天平 瑞士Mettler-Toledo 公司；γ放射免疫計(jì)數(shù)儀 上海核所日環(huán)光電儀器有限公司；scientz-IID型超聲波細(xì)胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；SPD-M20A高效液相色譜儀 日本島津公司；Benchepark Plus型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將雄性SD幼年大鼠分為對(duì)照組及人參莖葉總皂苷低、中、高劑量組，共4組，每組10只。人參莖葉總皂苷灌胃幼年大鼠的低、中、高劑量分別是0.175、0.35、0.7 g/（kg·d）（以體質(zhì)量計(jì)），對(duì)照組灌胃等體積雙蒸水，連續(xù)灌胃兩周[11]。

末次給藥前12 h稱(chēng)質(zhì)量，禁食不禁水，灌胃90 min后股動(dòng)脈取血。頸椎脫臼處死大鼠，摘取左側(cè)睪丸，稱(chēng)質(zhì)量。

1.3.2 給藥期間大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)量的測(cè)量

1.3.3 精子密度

頸椎脫臼處死大鼠，取出左側(cè)附睪置于20 mL小燒杯中，加0.1%葡萄糖任氏液2 mL，剪碎，振蕩，在30 ℃水浴鍋中保溫10 min使精子移動(dòng)到溶液中，取一滴置血球計(jì)數(shù)板上，顯微鏡下計(jì)算精子密度[12]。

1.3.4 血清中相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

全血放在4 ℃冰箱中靜置過(guò)夜，低溫3 000 r/min離心10 min得血清。用試劑盒測(cè)定血清中睪酮、DHT、LH和FSH的含量。

1.3.5 給藥組血清和對(duì)照組血清中成分的對(duì)比分析

從高劑量組和對(duì)照組的每只大鼠血清中各取0.5 mL集中到10 mL EP管中，加入5 mL甲醇渦旋5 min，10 000 r/min離心10 min，取上清，上清液在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，向其中加入1 mL甲醇溶解后轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中15 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)濾膜后，用高效液相色譜儀在25 ℃、203 nm波長(zhǎng)處以0.2 mL/min的流速分析高劑量組血清和對(duì)照組血清中成分的差異，色譜條件見(jiàn)表1。

表1 高劑量組血清和對(duì)照組血清中成分對(duì)比分析的HPLC條件Table 1 HPLC conditions for analyzing the composition difference in serum from high dose group and control group

1.3.6 TGSL及其含藥血清對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌功能的影響

1.3.6.1 TGSL溶液的配制

將TGSL溶于DMEM/F12培養(yǎng)液配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，按照無(wú)菌操作和互不污染的要求用無(wú)菌注射器吸取含藥血清，通過(guò)0.22 μm一次性無(wú)菌濾器，分裝到帶有標(biāo)記的EP管中，每管約1 mL，將這些EP管放置于－80℃冰箱備用。

1.3.6.2 含藥血清的處理

從高劑量給藥組的每只大鼠血清中各取0.5 mL集中到10 mL試管中，置于57 ℃水浴鍋中滅活30 min。將已滅活的含藥血清按照無(wú)菌操作和互不污染的要求用無(wú)菌注射器吸取含藥血清，通過(guò)0.22 μm一次性無(wú)菌濾器，分裝到帶有標(biāo)記的1.5 mL EP管中，每管約1 mL，將這些EP管放置于－80℃冰箱備用[13]。

1.3.6.3 大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)[14]

頸椎脫臼處死大鼠，按照無(wú)菌操作的要求，取出睪丸，4 ℃磷酸緩沖液液中清洗3次后置于冰浴的培養(yǎng)皿中，用眼科鑷剝離被膜、血管，將剝離好的睪丸用磷酸緩沖液清洗3次，置于兩個(gè)50 mL離心管中，加入Ⅱ型膠原酶緩沖液，35 ℃水浴中消化15 min，適當(dāng)搖晃。吸出上部液體后通過(guò)200目尼龍過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾。收集濾液于離心管，900 r/min離心10 min，棄去上清液，再加入磷酸緩沖液，搖勻，900 r/min離心10 min，如此共反復(fù)漂洗5次，棄上清。用含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×106個(gè)/mL，340 ?L/孔接種到48孔板，在35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后加入含藥血清或TGSL溶液。

將培養(yǎng)的大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞分為7組，分別加入60 ?L的DMEM/F12培養(yǎng)液作為對(duì)照組、20 ?L的TGSL溶液和40 ?L的DMEM/F12培養(yǎng)液、40 ?L的TGSL溶液和20 ?L的DMEM/F12培養(yǎng)液、60 ?L的TGSL溶液、20 ?L的高劑量給藥組大鼠含藥血清和40 ?L的DMEM/F12培養(yǎng)液、40 ?L的高劑量給藥組大鼠含藥血清和20 ?L的DMEM/F12培養(yǎng)液、60 ?L的高劑量給藥組大鼠含藥血清，使TGSL溶液及其含藥血清的體積分?jǐn)?shù)分別為0%（對(duì)照組）、5%、10%、15%。每組設(shè)12個(gè)復(fù)孔。

1.3.6.4 睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的測(cè)量，細(xì)胞存活率和活力的檢測(cè)[14]

加入TGSL溶液及其含藥血清4 h后，收集孔板中每孔的上清液，用放射免疫試劑盒測(cè)量上清液中睪酮的含量，將上清液吸去后加入200 ?L 0.05%的胰酶，輕輕吹打2 min后加入200 ?L含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，取一滴細(xì)胞懸液滴于載玻片上，加一滴0.4%的臺(tái)盼藍(lán)溶液，混勻，靜置3 min加蓋玻片，顯微鏡下觀察，活細(xì)胞為無(wú)色透明，死細(xì)胞為藍(lán)色，計(jì)算每組細(xì)胞的存活率。

加入TGSL溶液及其含藥血清4 h后，向孔板加入20 ?L/孔的5 mg/mL的噻唑藍(lán)溶液（以無(wú)血清培養(yǎng)基配制），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后仔細(xì)吸去上清，每孔加入400 ?L二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），輕輕振蕩，1 h后在570 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，以觀測(cè)TGSL溶液及其含藥血清對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力的影響。

1.3.6.5 cAMP含量的測(cè)定

加入TGSL溶液及其含藥血清4 h后，吸去上清液，用PBS液清洗3次后，再加入400 ?L的PBS液，用超聲波細(xì)胞粉碎儀使睪丸間質(zhì)細(xì)胞破碎。吸取每孔的混懸液，15 000 r/min離心10 min得上清液，用cAMP酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中cAMP的含量。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均用 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGSL對(duì)幼年大鼠血清睪酮和DHT含量的影響

由表2可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，給藥組幼年大鼠血清中睪酮和DTH含量劑量依賴(lài)性地顯著下降（P＜0.01）。

表2 人參莖葉總皂苷對(duì)幼年大鼠血清睪酮和DHT含量的影響TTaabbllee 22 EEffffeecctt of TGSL on the contents of testosterone and DHT in

表2 人參莖葉總皂苷對(duì)幼年大鼠血清睪酮和DHT含量的影響TTaabbllee 22 EEffffeecctt of TGSL on the contents of testosterone and DHT in

注：**.與對(duì)照組相比，有極顯著差異（P＜0.01）。下同。

組別 睪酮含量/（ng/mL） DHT含量/（nmol/L）對(duì)照組 0.89±0.41 19.06±3.55 TGSL低劑量給藥組 0.61±0.17** 17.37±1.25** TGSL中劑量給藥組 0.44±0.19** 15.66±2.03** TGSL高劑量給藥組 0.37±0.23** 14.25±1.11**

2.2 TGSL對(duì)幼年大鼠血清中FSH和LH含量的影響

表3 人參莖葉總皂苷對(duì)幼年大鼠血清中FSH和LH含量的影響TTaabbllee 33 EEffffect of TGSL on the contents of FSH and LH in serum

表3 人參莖葉總皂苷對(duì)幼年大鼠血清中FSH和LH含量的影響TTaabbllee 33 EEffffect of TGSL on the contents of FSH and LH in serum

組別 FSH含量/（IU/L） LH含量/（ng/L）對(duì)照組 4.32±0.17 13.62±0.18 TGSL低劑量給藥組 4.63±0.16** 14.42±0.24** TGSL中劑量給藥組 4.75±0.25** 14.98±0.19** TGSL高劑量給藥組 4.89±0.43** 15.43±0.25**

由表3可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，TGSL給藥組幼年大鼠血清中FSH和LH含量劑量依賴(lài)性地顯著增加（P＜0.01）。

2.3 TGSL對(duì)幼年大鼠睪丸質(zhì)量、體質(zhì)量和睪丸臟器系數(shù)的影響

表4 人參莖葉總皂苷對(duì)幼年大鼠睪丸質(zhì)量、體質(zhì)量和睪丸臟器系數(shù)的影響Table 4 Effect of TGSL on testis weight, body weight and testis weight coeffi

表4 人參莖葉總皂苷對(duì)幼年大鼠睪丸質(zhì)量、體質(zhì)量和睪丸臟器系數(shù)的影響Table 4 Effect of TGSL on testis weight, body weight and testis weight coeffi

注：*.與對(duì)照組相比，有顯著差異（P＜0.05）。下同。

組別 睪丸質(zhì)量/g 體質(zhì)量增加量/g 睪丸臟器系數(shù)/（mg/10 g）對(duì)照組 1.41±0.17 107.02±6.28 42.22±3.02 TGSL低劑量給藥組 1.13±0.08* 97.21±3.25** 46.97±3.69* TGSL中劑量給藥組 1.01±0.11** 94.53±4.55** 51.22±5.14** TGSL高劑量給藥組 0.91±0.09** 92.85±4.99** 52.84±4.69**

由表4可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，TGSL給藥組的睪丸質(zhì)量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），體質(zhì)量的增加量極顯著降低（P＜0.01），睪丸臟器系數(shù)顯著提高（P＜0.05或P＜0.01）。

2.4 TGSL對(duì)幼年大鼠精子密度的影響

表5 人參莖葉總皂苷對(duì)幼年大鼠精子密度的影響Table 5 Effect of TGSL on sperm density of juvenile male rats

由表5可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，TGSL給藥組幼年大鼠的精子密度劑量依賴(lài)性地顯著降低（P＜0.01）。

2.5 給藥組血清和對(duì)照組血清中成分的對(duì)比分析

如圖1所示，與對(duì)照組相比，TGSL高劑量組大鼠血清中有5個(gè)成分是對(duì)照組中所沒(méi)有的（箭頭標(biāo)示處）。

圖1 高劑量組血清和對(duì)照組血清中成分對(duì)比分析的高效液相色譜圖Fig.1 Comparative analysis by HPLC of serum components of the high dose group and the control group

2.6 TGSL及其含藥血清對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞存活率和細(xì)胞活力的影響

表6 人參莖葉總皂苷及其含藥血清對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞存活率和活力的影響Table 6 Effects of rat serum containing TGSL and TGSL on the viability and vitality of leydig cells

表6 人參莖葉總皂苷及其含藥血清對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞存活率和活力的影響Table 6 Effects of rat serum containing TGSL and TGSL on the viability and vitality of leydig cells

組別 體積分?jǐn)?shù)/% 細(xì)胞存活率/% A570nm對(duì)照組 0 98±1 1.25±0.09 TGSL溶液5 95±2 1.01±0.09* 10 96±2 0.89±0.05** 15 94±2 0.78±0.16** TGSL含藥血清5 97±2 1.19±0.05 10 97±2 1.03±0.08** 15 96±2 0.92±0.11**

由表6可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，加入TGSL及其含藥血清后睪丸間質(zhì)細(xì)胞的活率無(wú)變化，但是細(xì)胞的活力隨著含藥血清體積分?jǐn)?shù)的增加而顯著下降（P＜0.01）。

2.7 TGSL及其含藥血清對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌和細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的影響

表7 人參莖葉總皂苷及其含藥血清對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌和細(xì)胞內(nèi)cAMP的影響（x ±s，n==1122）Table 7 Effect of rats serum containing TGSL and TGSL on testosterone and cAMP levels in leydig cell (x ±s,, n = 1122))

由表7可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，加入TGSL及其含藥血清后，睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中睪酮的含量劑量依賴(lài)性顯著下降（P＜0.01），睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量隨著含藥血清體積分?jǐn)?shù)的增加而顯著下降（P＜0.01）。

3 討 論

雄性的主性器官是睪丸。睪丸分泌的最主要雄激素為睪酮，主要來(lái)自睪丸間質(zhì)細(xì)胞。睪酮能通過(guò)血睪屏障進(jìn)入曲細(xì)精管，與生精細(xì)胞內(nèi)的睪酮受體結(jié)合，促進(jìn)精子發(fā)生和成熟。睪酮與支持細(xì)胞分泌的雄激素結(jié)合蛋白相結(jié)合，可提高曲細(xì)精管內(nèi)睪酮的濃度，維護(hù)著精子發(fā)生的特殊環(huán)境，臨床上睪酮缺乏的患者表現(xiàn)為原發(fā)性無(wú)精子或精子發(fā)生完全停止[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)用TGSL灌胃雄性幼年大鼠兩周后，發(fā)現(xiàn)幼年大鼠血清睪酮和精子密度顯著降低。這是由于TGSL抑制了睪酮的分泌，睪酮水平的降低抑制精子的發(fā)生。

經(jīng)5α-還原酶的作用，睪酮轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮[17]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示TGSL灌胃雄性幼齡大鼠兩周后，給藥組大鼠血清中雙氫睪酮含量顯著低于對(duì)照組，推測(cè)是由于給藥組大鼠血清中睪酮含量的顯著下降使得雙氫睪酮的水平也相應(yīng)下降，或者TGSL可能通過(guò)抑制5α-還原酶的作用從而降低血清中雙氫睪酮的含量。

在青春期，睪酮和雙氫睪酮的大量分泌能促進(jìn)性器官和副性器官的生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)第二性征的出現(xiàn)，并維持其正常狀態(tài)，表現(xiàn)為睪丸增大、陰莖變長(zhǎng)、出現(xiàn)胡須等雄性體征，開(kāi)始分泌精液[18]。睪酮能促進(jìn)青春期階段的蛋白質(zhì)合成（同化作用），抑制蛋白質(zhì)的降解（異化作用），促進(jìn)骨骼的生長(zhǎng)和鈣磷在骨中沉淀，還能提高基礎(chǔ)代謝率，使肌肉增長(zhǎng)，體質(zhì)量增加[19]。

本實(shí)驗(yàn)用大鼠為6周齡雄性幼年大鼠，飼養(yǎng)兩周后大鼠已進(jìn)入了性成熟階段，本實(shí)驗(yàn)覆蓋大鼠的性成熟過(guò)程。TGSL灌胃雄性幼年大鼠兩周后，發(fā)現(xiàn)幼年大鼠睪丸質(zhì)量、體質(zhì)量增加量顯著降低，但是睪丸臟器系數(shù)顯著升高。這可能是由于TGSL抑制大鼠睪酮的分泌，睪酮水平的顯著下降抑制了幼年大鼠睪丸的發(fā)育和蛋白質(zhì)的合成，從而使睪丸質(zhì)量和體質(zhì)量的增加量顯著降低。在睪丸臟器系數(shù)的計(jì)算公式中，睪丸質(zhì)量是分子，體質(zhì)量是分母，由于體質(zhì)量隨著給藥劑量的增加而顯著降低，所以睪丸臟器系數(shù)隨著給藥劑量的增加而顯著升高。

下丘腦-垂體-睪丸是最重要的男性生殖軸。下丘腦分泌促性腺激素釋放激素，經(jīng)垂體門(mén)脈系統(tǒng)到達(dá)腺垂體遠(yuǎn)側(cè)部，作用于促性腺激素細(xì)胞，使之分泌LH、FSH。LH和FSH再經(jīng)血液運(yùn)輸?shù)讲G丸，與睪丸內(nèi)細(xì)胞上的受體結(jié)合，從而啟動(dòng)間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)睪酮的合成和產(chǎn)生其他生物學(xué)效應(yīng)[20]。當(dāng)血中睪酮升高到一定程度后，睪酮又可以負(fù)反饋方式作用于下丘腦和腺垂體，分別抑制促性腺激素釋放激素、FSH和LH的分泌，從而使血液中的睪酮濃度維持在一定的水平[21]。本實(shí)驗(yàn)中，人參莖葉總皂苷給藥組血清睪酮濃度顯著降低，睪酮對(duì)下丘腦和垂體的負(fù)反饋抑制減弱，所以大鼠血清中LH和FSH的濃度顯著上升。

在睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，cAMP的主要作用是促進(jìn)類(lèi)固醇激素的合成，進(jìn)而使睪酮的分泌量增加。cAMP對(duì)類(lèi)固醇生成途徑的作用之一是加速膽固醇裂解成孕烯醇酮，這是所有類(lèi)固醇生物合成的第一步。cAMP作用的可能途徑有[22]：1）增大還原性輔酶Ⅱ的濃度，這是膽固醇裂解為孕烯醇酮所需的輔因子；2）通過(guò)激活膽固醇酯酶，提高膽固醇的濃度；3）轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇進(jìn)入線粒體，在膽固醇側(cè)鏈裂解酶的作用下，膽固醇被裂解成孕烯醇酮；4）激活膽固醇側(cè)鏈裂解酶系統(tǒng)；5）轉(zhuǎn)運(yùn)孕烯醇酮離開(kāi)線粒體。細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，激活蛋白激酶A。蛋白激酶A能將睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)某些特定的調(diào)控因子或酶上的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化，從而啟動(dòng)Leydig細(xì)胞內(nèi)合成睪酮的酶系統(tǒng)[20]。所以說(shuō)，cAMP是睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)睪酮合成的主要信使之一。

本實(shí)驗(yàn)用高效液相色譜分析高劑量組大鼠血清和對(duì)照組血清中成分的差異，發(fā)現(xiàn)高劑量組大鼠血清中有5個(gè)成分是對(duì)照組中所沒(méi)有的，這說(shuō)明TGSL能夠被雄性大鼠吸收或轉(zhuǎn)化，并移行入血，形成TGSL的藥效物質(zhì)，從而對(duì)雄性大鼠生殖系統(tǒng)產(chǎn)生藥理作用，但是由于血清中的成分含量很低，暫時(shí)不能確定這5種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

將TGSL及高劑量組的大鼠含藥血清按不同體積分?jǐn)?shù)加入到體外培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的活率無(wú)顯著變化，但是細(xì)胞活力、睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌能力和細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平隨著體積分?jǐn)?shù)的增加而顯著降低。這說(shuō)明，TGSL及含藥血清中的有效成分可能通過(guò)蛋白激酶A途徑抑制間質(zhì)細(xì)胞睪酮的合成，從而使血清中的睪酮水平下降。同時(shí)，這也揭示了在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中給藥組大鼠LH和FSH升高，但是給藥組大鼠血清中睪酮水平依然顯著下降的原因。

TGSL能使幼年雄性大鼠血清中睪酮和DHT水平顯著降低，進(jìn)而使精子密度、睪丸質(zhì)量和體質(zhì)量增加量顯著降低。這在保健品的食用方面給予我們一個(gè)提示，男性青少年兒童不宜長(zhǎng)時(shí)間或大量食用含有人參葉或人參的保健品或食品，這會(huì)影響他們生殖系統(tǒng)的發(fā)育。

另外，前列腺癌、前列腺增生、脂溢性脫發(fā)等與雄激素關(guān)系密切[23]。目前，前列腺癌內(nèi)分泌治療的機(jī)制是降低血液循環(huán)中的雄激素水平[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGSL能顯著降低大鼠血清睪酮和雙氫睪酮濃度，這提示可進(jìn)一步研究TGSL對(duì)上述病癥的預(yù)防和治療。

參考文獻(xiàn)：

[1] 高學(xué)敏. 中藥學(xué)[M]. 北京: 中國(guó)中醫(yī)藥出版社, 2002: 497.

[2] 李時(shí)珍. 本草綱目[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2010: 563-567.

[3] 黎陽(yáng), 張鐵軍, 劉素香, 等. 人參化學(xué)成分和藥理研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2009, 40(1): 164.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中國(guó)藥典. 一部[S]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010: 365.

[5] 朱玉琢, 邢沈陽(yáng), 孫凱, 等. 人參莖葉總皂甙的遺傳毒性研究[J]. 衛(wèi)生毒理學(xué)雜志, 1994, 8(2): 114-115.

[6] 房學(xué)東, 盧堯, 劉建偉. 人參莖葉總皂甙對(duì)小鼠體細(xì)胞及生殖細(xì)胞的誘變研究[J]. 吉林中醫(yī)藥, 1996(3): 38-39.

[7] 朱玉琢, 邢沈陽(yáng), 龐慧民, 等. 人參莖葉總皂甙對(duì)遺傳物質(zhì)損傷的防護(hù)作用[J]. 白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1994, 20(4): 340-341.

[8] 姜官鳳, 孫凱. 人參莖葉總皂甙對(duì)小鼠雄性生殖細(xì)胞的誘變研究[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1992, 18(2): 110.

[9] 朱玉琢, 劉冰, 孫凱. 人參莖葉總皂甙對(duì)甲基磺酸甲酯誘發(fā)小鼠精子非程序DNA合成的抑制作用[J]. 衛(wèi)生毒理學(xué)雜志, 1993, 7(4): 244-245.

[10] 盧堯, 龐慧民, 武廣恒. 人參莖葉總皂甙對(duì)遺傳物質(zhì)損傷的修復(fù)作用及其時(shí)間效應(yīng)[J]. 癌變·畸變·突變, 1994, 6(3): 10-11.

[11] 許立, 劉曉輝, 張莉. 人參總皂苷對(duì)小鼠睪丸NO、NOS及總抗氧化能力的影響[J]. 武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 15(5): 507-508.

[12] 魏偉, 吳希美, 李元建. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 4版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2010: 1401.

[13] 李儀奎. 中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 2版. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2006: 50-61.

[14] 鄭娟, 趙瑩, 王麗蕃, 等. 藏黨參皂苷對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的影響及作用機(jī)制[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2011, 17(22): 145-148.

[15] 姚泰. 生理學(xué)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2003: 602.

[16] 宋博, 蔡志明. 精子形成的調(diào)控機(jī)制及其進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代泌尿外科雜志, 2011, 16(6): 575-576.

[17] 潘繼升, 王永晨, 蔡麗敏. 5α-還原酶在相關(guān)疾病中的作用[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2011, 17(17): 2571-2573.

[18] 竇兆華. 生殖生物學(xué)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2007: 37.

[19] 洪鍇, 姜輝. 睪酮對(duì)骨骼系統(tǒng)、肌肉和脂肪的影響[J]. 國(guó)際生殖健康/計(jì)劃生育雜志, 2011, 30(1): 26-28.

[20] 王一飛. 人類(lèi)生殖生物學(xué)[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社, 2005: 49; 46-47.

[21] 王穎, 佟倜, 孫迎春. 下丘腦-垂體-睪丸軸激素的振蕩行為與非線性動(dòng)力學(xué)模型[J]. 東北師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 41(2): 92-94.

[22] 朱長(zhǎng)虹. 生殖藥理學(xué)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2007: 13.

[23] 張樹(shù)棟, 馬潞林. 雄激素缺乏與老年疾病的關(guān)系[J]. 臨床泌尿外科雜志, 2008, 23(4): 317-319.

[24] CANNATA D H, KIRSCHENBAUM A, LEVINE A C. Androgen deprivation therapy as primary treatment for prostate cancer[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2012, 97(2): 360-365.

Effects of Total Ginsenosides from Ginseng Stems and Leaves on Reproductive System of Juvenile Male Rats and Its Mechanism

HU Hua-gang1, XIAO Xuan2, LIU Hui-min1, SUN Wan-juan1, TANG Xiao-jing1, PIAO Xiang-lan1, XU Si-fan1,*
(1. State Nationalities Affairs Commission and Department of Educational Key Laboratory of Minority Traditional Medicine, MINZU University of China, Beijing 100081, China; 2. Institute of Medicinal Plant Development, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100193, China )

Objective: To study the effect of total ginsenosides from ginseng stems and leaves (TGSL) on the reproductive system of juvenile male rats and its mechanism. Methods: Forty SD rats were randomized into control group and three administration groups. The administration groups and control group were given TGSL at high, middle and low doses and water by intragastric administration, respectively. After administration for two weeks, testosterone, dihydrotestosterone (DHT), luteinizing hormone (LH), follicle-stimulating hormone (FSH), testis weight, body weight, testis weight coefficient and sperm density were tested. The difference in serum components between high dose group and control group was compared by HPLC. TGSL and serum from the high-dose group were added into the culture medium of rat leydig cells, respectively, at volume fractions of 0 (control group), 5%, 10% and 15%. Leydig cell viability and vitality, the content of testosterone in cell culture medium and intracellular cAMP were measured. The content of testosterone was tested by radioimmunoassay. DHT, FSH, LH and intracellular cAMP were measured by ELISA. Cell viability and vitality of cultured rat leydig cells were tested by placenta blue staining and MTT assay. Finally, SPSS software was used to analyze the differences among different groups.Results: The contents of testosterone and DHT in serum and sperm density of three administration groups significantly reduced in a dosedependent manner by total ginsenosides (P ＜ 0.01). Compared with the control group, testis weight (P ＜ 0.05) and the increase of rat body weight (P ＜ 0.01) in the administration groups significantly decreased, but the contents of LH and FSH (P ＜ 0.01) in serum and testis weight coefficient (P ＜ 0.05) in the administration groups significantly increased. Five compounds were detected in the serum from the high dose group with HPLC, but were not observed in the serum from the control group. The secretion of testosterone and intracellular cAMP in leydig cells could be inhibited by TGSL and TGSL-containing serum. Conclusion：TGSL may reduce the generation of testosterone in serum of juvenile male rats through PKA pathway to inhibit testicular development and sperm production, and then affect the growth and development of the reproductive system of juvenile male rats.

total ginsenosides from ginseng stems and leaves; testosterone; spermatozoa; luteinizing hormone; folliclestimulating hormone

TS202.1

A

1002-6630（2014）03-0187-06

10.7506/spkx1002-6630-201403038

2013-05-22

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30973956）

胡華剛（1983—），男，博士研究生，研究方向?yàn)樯乘幚韺W(xué)。E-mail：tangang_666@163.com

*通信作者：徐斯凡（1953—），男，教授，本科，研究方向?yàn)槊褡逅幩幚韺W(xué)。E-mail：sifanxu@126.com