鄭 義，王衛(wèi)東，李 勇，朱園園，郭 靜

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇 徐州 221000；2.江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221000）

高良姜多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

鄭 義1,2，王衛(wèi)東1,2，李 勇1,2，朱園園1，郭 靜1

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇 徐州 221000；2.江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221000）

通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲得了熱水浸提高良姜多糖的最佳工藝；以清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基能力、還原力、清除羥自由基能力、螯合鐵離子能力為指標(biāo)，評(píng)價(jià)了高良姜多糖的抗氧化活性。結(jié)果表明，熱水浸提高良姜多糖的最佳工藝條件為液料比43∶1（mL/g）、浸提溫度95 ℃、浸提時(shí)間3 h，在此條件下多糖得率實(shí)測(cè)值為11.81%。高良姜多糖具有較好的抗氧化活性，清除自由基能力、還原力和螯合鐵離子能力均表現(xiàn)出一定的質(zhì)量濃度依賴(lài)性；高良姜多糖清除DPPH自由基、清除羥自由基和螯合鐵離子能力的半數(shù)有效質(zhì)量濃度（EC50）分別為（0.59±0.01）、（0.05±0.003）g/L和（2.75±0.2）g/L。

高良姜；多糖；響應(yīng)面法；抗氧化活性

高良姜為姜科植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的干燥根莖，別名風(fēng)姜、小良姜、高涼姜、良姜等，為衛(wèi)生部認(rèn)定的藥食同源的物品之一。高良姜營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含有豐富的糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、微量元素等。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)高良姜的研究主要集中于黃酮[1-3]、芳香油[4-5]等化學(xué)成分及抑菌、抗腫瘤、降血脂等藥理功能上[6-9]，有關(guān)高良姜多糖的研究極少，而關(guān)于春砂仁、莪術(shù)等其他姜科植物多糖的研究較多，并發(fā)現(xiàn)多種姜科植物多糖具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等作用[10-11]。目前有關(guān)高良姜多糖的提取工藝及抗氧化性能尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用熱水浸提法提取高良姜多糖，并基于響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，評(píng)價(jià)高良姜多糖的抗氧化活性，旨在為高良姜資源的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮高良姜產(chǎn)地為廣東徐聞，品種為牛姜，5年生；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、菲咯嗪（ferrozine） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；THZ-82恒溫振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司；R201L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠(chǎng)；3K30高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 高良姜多糖的提取

將新鮮高良姜用清水洗凈，去皮，適當(dāng)切片，60 ℃干燥，恒質(zhì)量后粉碎，過(guò)60目篩，干燥保存待用。稱(chēng)取一定量的高良姜干粉，加適量水，恒溫振蕩器中提取一定時(shí)間，抽濾后得多糖提取液。多糖提取液進(jìn)行濃縮、4 ℃醇析、離心，所得沉淀用無(wú)水乙醇洗滌3次，沉淀晾干。Sevag法脫蛋白，反復(fù)進(jìn)行5次。自來(lái)水透析48 h，蒸餾水透析24 h。透析液濃縮后冷凍干燥得高良姜多糖。稱(chēng)取一定量高良姜多糖，用蒸餾水配制成20 g/L母液，4 ℃保存，備用。

1.3.2 多糖含量測(cè)定

多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[12]。

多糖得率Y/%=高良姜多糖質(zhì)量/高良姜干粉質(zhì)量×100 1.3.3 單因素試驗(yàn)

設(shè)定液料比20∶1（mL/g）、浸提溫度90 ℃、浸提時(shí)間2 h，固定其他因素，分別考察液料比、浸提溫度和時(shí)間對(duì)多糖得率的影響。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。1.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采取Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排三因素三水平試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平表如表1所示。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表Table1 Coded levels for factors used in Box-Behnken experimental design

1.3.5 抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率測(cè)定

DPPH自由基清除率測(cè)定參考Wu Huichun等[13]的方法，取不同質(zhì)量濃度（0.3～10 g/L）的高良姜多糖，在517 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。清除率計(jì)算公式如下：

式中：Ac為1.5 mL蒸餾水加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液的吸光度；Ai為1.5 mL樣品液加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液的吸光度；Aj為1.5 mL樣品液加1.5 mL 95%乙醇溶液的吸光度。

1.3.5.2 還原力測(cè)定

還原力測(cè)定方法采用鐵氰化鉀法[14]。量取不同質(zhì)量濃度（0.05～1.5 g/L）的樣液2 mL，加入2 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴下保溫20 min，再加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液，混勻，3 000 r/min離心10 min。取上清液2 mL，加入2 mL去離子水和0.4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3溶液，混勻后在50 ℃水浴下保溫10 min，當(dāng)體系溶液顏色由黃色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度A700nm。以去離子水代替樣品作為空白對(duì)照，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.5.3 羥自由基清除率測(cè)定

羥自由基清除率測(cè)定采用鄰二氮菲比色法[15]。樣品溶液質(zhì)量濃度為0.01～2 g/L，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。

損傷管：取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲的無(wú)水乙醇溶液加入1 mL磷酸鹽緩沖液（0.15 mol/L，pH 7.40）和0.5 mL去離子水，混勻后加入0.5 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，混勻后再加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)0.01%的H2O2，37 ℃水浴60 min后，536 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度為A損。

未損傷管：以0.5 mL去離子水代替損傷管中的H2O2，重復(fù)上述操作步驟，測(cè)其吸光度為A未損。

樣品管：0.5 mL樣品溶液代替損傷管中的去離子水，測(cè)其吸光度為A樣。

樣品參比：取1 mL 0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.40）和0.5 mL樣品溶液混合，加入1.5 mL去離子水，不需水浴，測(cè)其吸光度為A參。

空白參比：取1 mL 0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.40）加入2 mL去離子水，作為空白調(diào)零A空。

清除率計(jì)算公式為：

1.3.5.4 鐵離子螯合能力測(cè)定

鐵離子鰲合能力的測(cè)定采用 Decker等[16]的方法，略有改動(dòng)。在2 mL不同質(zhì)量濃度（0.5～10 g/L）的樣品溶液中，加入0.02 mL 5 mmol/L的FeCl2溶液，再加0.2 mL 5 mmol/L菲咯嗪，室溫靜置10 min，加入等體積的蒸餾水，搖勻，于562 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。上述反應(yīng)體系中，以蒸餾水替代樣品溶液作為空白對(duì)照，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取其平均值。鐵離子鰲合能力計(jì)算公式如下：

鐵離子螯合率/%=（A0－A1）/A0×100

式中：A0和A1分別為為空白對(duì)照和樣品或陽(yáng)性對(duì)照的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)多糖得率的影響

圖1 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of polysaccharides

由圖1可知，多糖得率隨液料比的增大而增加，液料比達(dá)到40∶1（mL/g）后，多糖得率增加緩慢，表明此時(shí)浸提過(guò)程已達(dá)到基本穩(wěn)定。液料比過(guò)大，后續(xù)濃縮時(shí)耗能加大，從降低成本、節(jié)約能源角度考慮，液料比宜在40∶1（mL/g）左右。

2.1.2 浸提溫度對(duì)多糖得率的影響

圖2 浸提溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature time on the yield of polysaccharides

由圖2可知，溫度在60～90 ℃之間，多糖得率隨著浸提溫度的升高而增加，溫度從90 ℃升高到100 ℃，多糖得率變化不大，故選擇較優(yōu)浸提溫度為90 ℃。

2.1.3 浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

圖3 浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

由圖3可知，多糖得率在1.5～3.0 h時(shí)間內(nèi)呈顯著增加的趨勢(shì)，浸提時(shí)間超過(guò)3.0 h后，多糖得率增幅趨于平緩，此時(shí)多糖已基本浸提完全，故選擇3.0 h為浸提時(shí)間較優(yōu)值。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Design and results of experiments

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗(yàn)

對(duì)表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)用多元回歸擬合后，得到多糖得率Y與液料比x1、浸提溫度x2和浸提時(shí)間x3的回歸方程：

對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance for the regression model

該模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），決定系數(shù)R2為0. 974，校正決定系數(shù)為0.942，信噪比RSN為14.79，可知該回歸方程擬合度和可信度均很高，故可用于設(shè)計(jì)范圍內(nèi)的預(yù)測(cè)。

對(duì)表3回歸模型系數(shù)的顯著性分析可見(jiàn)，一次項(xiàng)中，x2、x3極顯著，x1達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；平方項(xiàng)的回歸系數(shù)均極顯著，說(shuō)明各因素與多糖得率之間存在明顯的二次關(guān)系；交互項(xiàng)中x2x3的回歸系數(shù)達(dá)到極顯著水平，表明浸提溫度與浸提時(shí)間的交互作用對(duì)多糖得率有顯著影響。

2.2.2 兩因素間的交互效應(yīng)分析

由表3可知，浸提溫度與浸提時(shí)間的交互作用對(duì)多糖得率有顯著影響，固定液料比于零水平，繪出浸提溫度與浸提時(shí)間的響應(yīng)面，如圖4所示。隨著浸提溫度的升高與浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率呈現(xiàn)出先急劇增加后緩慢下降的趨勢(shì)。當(dāng)浸提溫度在90～100 ℃，浸提時(shí)間在2.9～3.3 h時(shí)，多糖得率較高。

圖4 浸提溫度與浸提時(shí)間的交互效應(yīng)對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Interactive effect of extraction temperature and extraction time on the yield of polysaccharides

2.2.3 最佳條件優(yōu)化及驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)所得回歸模型對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為液料比42.75∶1（mL/g）、浸提溫度94.95 ℃、浸提時(shí)間3.06 h，在此條件下高良姜多糖得率的理論得率為11.73%?？紤]實(shí)際操作情況，將最佳提取工藝修正為液料比43∶1（mL/g）、浸提溫度95 ℃、浸提時(shí)間3 h。在此修正條件下，實(shí)測(cè)提取率為11.81%，表明該回歸模型具有較好的預(yù)測(cè)性能，對(duì)于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的借鑒意義。

2.3 高良姜多糖的抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基能力

圖5 高良姜多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effects of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance against DPPH radicals

由圖5可知，在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍，高良姜多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。質(zhì)量濃度為0.1 g/L時(shí)，清除率為22.14%，質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)，清除率為66.69%，質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)，清除率達(dá)到了98.36%。當(dāng)質(zhì)量濃度低于3 g/L時(shí)，高良姜多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力均低于陽(yáng)性對(duì)照VC；而當(dāng)質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)，高良姜多糖的清除率高于VC。

半數(shù)有效濃度（median effective concentration，EC50）是指清除率為50%時(shí)的樣品質(zhì)量濃度，EC50可作為評(píng)價(jià)抗氧化能力的重要參數(shù)。如某種物質(zhì)的EC50低于10 g/L，則表明其具有很好的抗氧化活性[17]。采用Logit回歸計(jì)算出高良姜多糖及VC的EC50分別為（0.59±0.01）、（0.09±0.001） g/L。高良姜多糖清除DPPH自由基的EC50遠(yuǎn)小于10 g/L，由此可見(jiàn)高良姜多糖具有明顯清除DPPH自由基的能力。

有關(guān)植物多糖清除DPPH自由基能力已有較多研究，李嬌等[18]報(bào)道了蘆筍多糖的EC50為（1.50±0.75）g/L；葛霞等[19]用D301R型大孔樹(shù)脂純化制備青錢(qián)柳多糖，在質(zhì)量濃度為4 g/L時(shí)，青錢(qián)柳多糖對(duì)DPPH自由基的清除率為71.8%。由此可見(jiàn)，高良姜多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯高于蘆筍多糖、青錢(qián)柳多糖等植物多糖。

2.3.2 還原力

圖6 高良姜多糖的還原力Fig.6 Reducing power of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance

由圖6可知，在0.05～1.5 g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，高良姜多糖的還原力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1 g/L時(shí)，吸光度為0.285；當(dāng)質(zhì)量濃度為1.5 g/L時(shí)，吸光度則達(dá)到了1.027。對(duì)于分光光度法而言，吸光度高于1.0時(shí)，測(cè)量結(jié)果的相對(duì)誤差較大，故不再進(jìn)一步加大高良姜多糖質(zhì)量濃度。在已測(cè)量的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，高良姜多糖的還原力不及VC。

馬虎飛等[20]報(bào)道了質(zhì)量濃度為1 g/L的陜北野生枸杞多糖的還原力為0.493；Wang Junlong等[21]通過(guò)微波輔助提取獲得了圓頭蒿多糖，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，在質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)，圓頭蒿多糖的還原力為0.86。與上述植物多糖相比，高良姜多糖表現(xiàn)出更強(qiáng)的還原力。

2.3.3 清除羥自由基能力

高良姜多糖對(duì)羥自由基的清除作用如圖7所示，在0.01～2.0 g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，高良姜多糖對(duì)羥自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增大而增大，質(zhì)量濃度為0.05 g/L時(shí)，清除率為50.42%，質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)，清除率為79.78%，在上述質(zhì)量濃度時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照VC的清除率分別為53.90%和74.07%，在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，高良姜多糖清除羥自由基的能力與VC基本相當(dāng)。采用Logit回歸計(jì)算出高良姜多糖及VC的EC50分別為（0.05±0.003）、（0.04±0.002）g/L，EC50也表明高良姜多糖與VC清除羥自由基的能力基本相當(dāng)。

圖7 高良姜多糖對(duì)羥自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance against hydroxyl radicals

Fu Jianfang等[22]評(píng)價(jià)了刺五加多糖的抗氧化活性，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 g/L時(shí)，刺五加多糖對(duì)羥自由基的清除率稍低于60%。鐘文武等[23]采用水提醇沉的方法對(duì)兩種不同寄主的扁枝槲寄生多糖進(jìn)行提取，兩種多糖清除羥自由基的EC50分別為0.541 1、0.590 2 g/L。由此可見(jiàn)，與刺五加多糖和扁枝槲寄生多糖相比，高良姜多糖具有更強(qiáng)的清除羥自由基能力。

2.3.4 鐵離子螯合能力

圖8 高良姜多糖對(duì)鐵離子的螯合作用Fig.8 Iron-chelating ability of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance

在質(zhì)量濃度為0.5～10 g/L的范圍內(nèi)，高良姜多糖對(duì)鐵離子的螯合能力呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。質(zhì)量濃度為3、5、10 g/L時(shí)，螯合率分別為52.53%、78.06%、96.48%。陽(yáng)性對(duì)照EDTA在質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)，螯合率已達(dá)到86.92%。高良姜多糖與EDTA對(duì)鐵離子螯合能力的EC50分別為（2.75±0.2）、（0.12±0.02） g/L。

Chen Huoliang等[24]采用DEAE-纖維素離子交換層析和Sepharose CL-6B凝膠過(guò)濾層析法分離純化得到3個(gè)香菇多糖組分LEPA1、LEPB1和LEPC1，在質(zhì)量濃度為4 g/L時(shí)，LEPB1和LEPC1的對(duì)鐵離子的螯合率分別為99.1%和99.2%。魏磊等[25]評(píng)價(jià)了雞油菌、變綠紅菇、蜜環(huán)菌和棕灰口蘑4種食用菌粗多糖的抗氧化活性，結(jié)果顯示4種食用菌粗多糖的鐵離子鰲合能力的EC50大小的順序?yàn)椋鹤鼗铱谀ⅲ?.69 g/L）＜雞油菌（3.22 g/L）＜蜜環(huán)菌（3.41 g/L）＜變綠紅菇（3.49 g/L）。高良姜多糖對(duì)鐵離子的螯合能力弱于香菇多糖和棕灰口蘑，而強(qiáng)于雞油菌、蜜環(huán)菌等，顯示出良好的鐵離子螯合能力。

3 結(jié) 論

本研究建立了熱水浸提高良姜多糖的最佳工藝條件，即液料比43∶1（mL/g）、浸提溫度95 ℃、浸提時(shí)間3 h，在此條件下多糖得率理論值為11.73%，驗(yàn)證值為11.81%。表明該模型具有較好的預(yù)測(cè)性能，對(duì)于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐具有一定借鑒意義。

在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍，高良姜多糖清除DPPH自由基能力、還原力、清除羥自由基能力、螯合鐵離子能力均隨質(zhì)量濃度增大而增大。高良姜多糖清除DPPH自由基、清除羥自由基和螯合鐵離子能力的EC50分別為（0.59±0.01）、（0.05±0.003）g/L和（2.75±0.2）g/L。高良姜多糖表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，可作為潛在天然抗氧化劑應(yīng)用于食品和保健品工業(yè)中，而有關(guān)高良姜多糖的結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化活性機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activities of Polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance

ZHENG Yi1,2, WANG Wei-dong1,2, LI Yong1,2, ZHU Yuan-yuan1, GUO Jing1
(1. College of Food (Biology) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221000, China; 2. Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe, Xuzhou 221000, China)

The conditions for hot water extraction of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance were optimized by Box-Behnken statistical design. The antioxidant activities of polysaccharides extracted from Alpinia officinarum Hance were investigated using four different in vitro antioxidant assays, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity, reducing power, hydroxyl radical scavenging activity and iron-chelating ability. The results showed that the optimal extraction conditions were found to be extraction at 95 ℃ for 3 h with a solvent-to-solid ratio of 43:1 (mL/g). The experimentally observed yield of polysaccharides extracted from Alpinia officinarum Hance was 11.81% under these conditions. The extracted polysaccharides had powerful antioxidant activities for free radical scavenging activity, reducing power and ironchelating capacity in concentration-dependent manner, with median effective concentration (EC50) of (0.59 ± 0.01), (0.05 ± 0.003) and (2.75 ± 0.2) g/L, respectively.

Alpinia offi cinarum Hance; polysaccharides; response surface methodology; antioxidant activity

R284.2

A

1002-6630（2014）02-0126-06

10.7506/spkx1002-6630-201402023

2013-04-28

蘇北科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（BC2011401）

鄭義（1982—），男，講師，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物與食品生物技術(shù)。E-mail：biozheng@gmail.com