趙奎軍，邢亞楠，韓嵐嵐，孫文鵬，張紅玉，李 冉，韓曉旭

（1.東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江農業(yè)職業(yè)技術學院，黑龍江 佳木斯 154007）

蘇云金芽胞桿菌Bt20菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

趙奎軍1，邢亞楠1，韓嵐嵐1，孫文鵬2，張紅玉1，李 冉1，韓曉旭1

（1.東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江農業(yè)職業(yè)技術學院，黑龍江 佳木斯 154007）

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）Bt20菌株為東北農業(yè)大學農業(yè)昆蟲與害蟲防治實驗室分離出來的具有獨立知識產權的菌株，其對鱗翅目幼蟲具有較強殺蟲活性，具有良好推廣應用價值。文章進行優(yōu)化Bt20菌株的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源材料研究，試驗以Bt20菌株發(fā)酵液吸光度值及對2齡小菜蛾的毒力效果為指標，首先采用單因素試驗對Bt20菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源及氮源進行優(yōu)化，篩選得到最佳碳源為玉米粉，最佳氮源為蠅蛆、酵母粉、魚粉、大豆粉；運用正交試驗設計方法對優(yōu)化后的碳、氮源進行正交試驗，明確Bt20菌株最佳液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：玉米粉3.0%、蠅蛆3.0%、大豆粉3.0%、酵母粉2.0%；最佳發(fā)酵培養(yǎng)基下，Bt20發(fā)酵液吸光度值為1.4733，發(fā)酵液處理2齡小菜蛾，3 d后校正死亡率為98.31%，顯著優(yōu)于魚粉發(fā)酵液的吸光度值1.0683及校正死亡率88.14%，提高發(fā)酵產物產量和毒力，降低生產成本，可為Bt20商品化及大規(guī)模應用提供基礎依據(jù)。

蘇云金芽胞桿菌Bt20；發(fā)酵條件優(yōu)化；最佳發(fā)酵培養(yǎng)基

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）是目前世界上產量和使用量最大的微生物殺蟲劑，已有200多種商品制劑，占整個生物殺蟲劑市場53%的份額，每年約產生120～140億美元稅收，在農林害蟲防治中應用廣泛，發(fā)展前景廣闊[1-2]。近年來，有許多新的Bt菌株不斷被發(fā)掘，但應用到生產中，還要經歷助劑、復配、發(fā)酵等研發(fā)過程。

高效培養(yǎng)基的篩選對Bt工業(yè)化發(fā)酵生產至關重要。Stanbury等估測生產Bt殺蟲劑所需原材料成本占整個生產成本35%～59%[3]。因此，找到能使蘇云金芽胞桿菌高產并降低生產成本的發(fā)酵原材料是規(guī)?；唐坊a的基礎[4]。研究表明，Bt對營養(yǎng)要求不嚴，在含氮量0.075%～0.225%、含糖量0.1%～1.5%、糖氮比0.44～20.0營養(yǎng)條件下生長良好[5]。國際上常用魚粉、大豆粉、昆蟲蛹、復雜的工農業(yè)廢物（木薯淀粉，玉米淀粉，稻草，麥麩，玉米漿酒，甘蔗糖蜜，干酪乳清和椰子廢物等）[6-11]及工業(yè)廢水、污泥[12-13]代替高成本發(fā)酵介質，降低Bt殺蟲劑生產成本。

雖然國內外對Bt發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究有諸多報道，發(fā)酵技術相當成熟，但對于不同的Bt菌株其最適發(fā)酵培養(yǎng)基及條件不同[5]。本研究主要采用單因素及正交試驗，以發(fā)酵液吸光度值及殺蟲毒力為標準，對東北農業(yè)大學農業(yè)昆蟲與害蟲防治實驗室獨立分離的對鱗翅目害蟲具有高毒力的蘇云金芽胞桿菌Bt20（以下簡稱Bt20）菌株發(fā)酵條件進行優(yōu)化，為該菌株產業(yè)化、規(guī)?；瘧玫於ɑA。

1 材料與方法

1.1 供式菌株

蘇云金芽胞桿菌Bt20菌株為東北農業(yè)大學農業(yè)昆蟲與害蟲防治實驗室保留菌株，中國微生物菌種保藏中心保藏（保藏號：GMCCNO，1710）。經前期工作篩選得到的對十字花科蔬菜危害嚴重的鱗翅目害蟲有較高毒力。

1.2 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，定容至1 L，pH 8.0的Tris-HCl調節(jié)pH 7.2，滅菌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 活化菌種的制備

挑取在LB固體培養(yǎng)基活化的菌種Bt20，一菌環(huán)接種到5 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30℃恒溫，230 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h后，以1%接種量再轉 接到新的5 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h，二次活化，準備接種。

1.4 碳源篩選

以2.0%蛋白胨作為培養(yǎng)基氮源，0.03% K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，0.04%CaCO3，0.02% ZnSO4作為培養(yǎng)基無機鹽，固定氮源及無機鹽不變，再分別以2.0%玉米粉、玉米淀粉作為碳源，篩選不同碳源對Bt20菌株發(fā)酵的影響。

1.5 氮源篩選

以2.0%玉米粉作培養(yǎng)基碳源，0.03%K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，0.04%CaCO3，0.02%ZnSO4作為培養(yǎng)基無機鹽，固定碳源及無機鹽不變，再分別以2.0%大豆粉、魚粉、蠅蛆、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨為氮源，篩選不同氮源對Bt20菌株發(fā)酵的影響。

1.6 碳氮源正交培養(yǎng)基篩選

基于碳、氮源單因素試驗結果，篩選出以玉米粉作為唯一碳源，大豆粉、魚粉、蠅蛆、酵母粉作為氮源的4個因素，每個因素設定3個水平，采用L18（37）正交表進行氮源比較分析試驗（見表1），隨機安排因素和濃度水平[14]。

1.7 培養(yǎng)方法

按各配方配制培養(yǎng)基50 mL，裝入250 mL三角瓶中滅菌，將在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中活化的Bt20按1%量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、230 r·min-1發(fā)酵振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵至芽胞晶體形成并有30%以上胞晶分離時終止，每個處理3次重復。

表1 Bt20菌株碳氮源正交試驗因素和水平設計Table 1 Orthogonal experimental factors and levels design of strain Bt20 carbon and nitrogen sources（%）

1.8 吸光度測定方法

以未發(fā)酵（空白）培養(yǎng)基作為對照，每隔4 h，吸取發(fā)酵培養(yǎng)液100 μL，加2 900 μL滅菌蒸餾水，稀釋30倍，分別測定各個配方培養(yǎng)液吸光度值OD600，依此繪制菌體生長曲線。

1.9 生物活性測定

采用葉片浸漬法，測定Bt20菌株各配方發(fā)酵液對小菜蛾2齡幼蟲的殺蟲效果。將各配方發(fā)酵液分別稀釋100、200、400、800、1 600、3 200倍，將無菌新鮮的白菜葉片剪成7 cm圓片，浸泡在稀釋好的發(fā)酵液中10 s，取出自然晾干，然后放入培養(yǎng)皿中，每個濃度接入20頭健康、大小一致的2齡小菜蛾幼蟲，重復3次，以加清水處理為空白對照，置于24～26℃，相對濕度60%～70%人工氣候箱中，飼養(yǎng)72 h后，調查存活死亡情況，計算LC50[15]。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)均采用Excel 2010和DPSv7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對Bt20發(fā)酵液OD值的影響

以2.0%蛋白胨作為氮源，圖1表明，不同碳源對Bt20整個發(fā)酵過程OD值的影響：0～8 h玉米淀粉對發(fā)酵液OD值的影響優(yōu)于玉米粉。但8 h至整個發(fā)酵周期結束，玉米粉對發(fā)酵液OD值的影響要高于玉米淀粉。

圖2表明，在P＜0.01水平下，振蕩培養(yǎng)40 h時，以玉米粉為主要碳源的Bt20發(fā)酵液最大吸光度值為0.729，極顯著優(yōu)于振蕩培養(yǎng)44 h時以玉米淀粉為碳源的發(fā)酵液最大吸光度值0.679?？傮w來看，Bt20對碳源的利用效率為，玉米粉優(yōu)于玉米淀粉。

圖1 不同碳源對Bt20菌株發(fā)酵過程吸光度值的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on the absorbance values in strain Bt20 fermentation process

圖2 不同碳源對Bt20菌株最大吸光度值的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on the maximum absorbance value of strain Bt20

2.2 不同氮源對Bt20發(fā)酵液OD值的影響

以2.0%玉米粉為碳源，針對氮源進行篩選的結果表明（見圖3、4）。Bt20對不同氮源的利用情況不同，其主要是利用有機氮源。圖4表明，對蠅蛆的利用效率最高，在P＜0.01水平下，極顯著優(yōu)于其他氮源，其最大吸光度值為0.654，較最低的硫酸銨高出兩倍，其次是酵母粉、魚粉OD值分別為0.623、0.582。雖然蛋白胨和大豆粉最大吸光度值存在極顯著差異，但從整個生長周期看（見圖3），蛋白胨最佳產胞時間為48 h，遠長于大豆粉最佳產胞時間36 h。，從發(fā)酵生產成本看，蛋白胨價格是大豆粉的8倍。從生產應用角度選擇大豆粉作為Bt20發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。被利用效率最低的是硫酸銨，為無機氮源，以其作氮源在整個發(fā)酵過程中Bt20不產生芽胞及伴胞晶體。綜合分析，Bt20對氮源利用效率從高到低依次為：蠅蛆＞酵母粉＞魚粉＞大豆粉＞蛋白胨＞硫酸銨。

2.3 Bt20發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源優(yōu)化正交試驗分析

Bt20碳源、氮源優(yōu)化正交試驗統(tǒng)計結果，見表2。

將Bt20碳源、氮源優(yōu)化正交試驗吸光度值統(tǒng)計結果用Duncan新復極差法進行分析，結果表明：玉米粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的唯一碳源時，其1水平（3.0%）的OD值＞2水平（2.5%）OD值＞3水平（2.0%）OD值，即玉米粉含量與發(fā)酵液OD值在一定范圍內呈正相關，說明碳源是Bt20生長發(fā)育的必需因素。因此，選擇1水平（含3.0%）玉米粉。

蠅蛆作為發(fā)酵培養(yǎng)的主要氮源，含豐富氨基酸，在其質量分數(shù)為0、1.5%、3.0%時，發(fā)酵液吸光度值分別為0.7173、0.7383、0.8878。說明其含量變化影響B(tài)t20發(fā)酵液的OD值，具有極顯著促進作用。由表3極差分析可知，蠅蛆極差R′= 0.2172，明顯高于其他材料提供的氮源極差，這說明蠅蛆是這幾種材料中氮源利用效率最高的材料，因此選3水平（含量3.0%）。

同理，由極差分析可知，其他各因素對Bt20發(fā)酵液的吸光度值影響從高到低依次為：E酵母粉＞A×B＞B魚粉＞D大豆粉＞A×C。其中，酵母粉3水平＞1水平＞2水平，選3水平（2.0%）；魚粉1水平＞3水平＞2水平，應選1水平，但是A×B互作對發(fā)酵吸光度值的影響比魚粉的影響要大，互作中3水平＞1水平＞2水平，因此魚粉應選3水平（0），表明在該培養(yǎng)基配方組合中魚粉對該發(fā)酵液OD值影響不大；而大豆粉3水平＞2水平＞1水平，應選3水平（3.0%）。

綜合上述試驗結果，Bt20最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基組合：A1B3C3D3E3即配方3玉米粉3.0%，蠅蛆3.0%，大豆粉3.0%，酵母粉2.0%。

圖3 不同氮源對Bt20菌株發(fā)酵過程吸光度值的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on the absorbance value in strain Bt20 fermentation process

圖4 不同氮源對Bt20菌株最大吸光度值的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the maximum absorbance value of strain Bt20

表2 Bt20菌株正交試驗設計與結果Table 2 Orthogonal experimental design and results of strain Bt20

表3 Bt20菌株正交試驗極差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experiment of strain Bt20

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基對Bt20菌株發(fā)酵毒力的影響

Bt20菌株在18種不同發(fā)酵配方下振蕩培養(yǎng)產生的發(fā)酵液對2齡小菜蛾的殺蟲效果如表4所示，Bt20不同配方振蕩培養(yǎng)產生的發(fā)酵液即使在較高稀釋倍數(shù)時也對2齡小菜蛾有較高殺蟲活性，如Bt20菌株在配方1、2、3、4、6振蕩培養(yǎng)產生的發(fā)酵液，即使在1 600倍的較高稀釋倍數(shù)下，對小菜蛾校正死亡率在72 h仍達65%以上，尤其是配方3的校正死亡率可達85%。在P＜0.05水平時，配方3 的100、200、400倍發(fā)酵液稀釋液對小菜蛾的校正死亡率均達最高水平，且差異不顯著，結果表明，Bt20菌株在配方3培養(yǎng)基中所產發(fā)酵液對2齡小菜蛾的殺蟲效果為18種配方中最高。

由表4可知，Bt20菌株在配方3培養(yǎng)基中產生發(fā)酵液對2齡小菜蛾的LC50為2.11×104cfu·mL-1，其次是配方4所產的發(fā)酵液對2齡小菜蛾的LC50為2.45×104cfu·mL-1，而配方18和16的發(fā)酵液毒力最差，其LC50分別為1.62×106和1.48×106cfu·mL-1，配方3、4的毒力約是配方18和16的60～77倍，也顯著優(yōu)于其他配方組合。因此，在配方3發(fā)酵培養(yǎng)基下產生的Bt20發(fā)酵液對2齡小菜蛾殺蟲活性最強。該結果與菌株發(fā)酵液OD值統(tǒng)計結果一致。

表4 Bt20碳氮源正交組合對小菜蛾殺蟲活性測定Table 4 Insecticidal activity of carbon and nitrogen source orthogonal combination of strain Bt20 against Plutella xylostella

續(xù)表4

4 討論與結論

本試驗結果表明，Bt20菌株發(fā)酵最優(yōu)配方為A1B3C3D3E3，即配方3：玉米粉3.0%，蠅蛆3.0%，大豆粉3.0%，酵母粉2.0%。經正交試驗極差分析得出，Bt20對作為碳源的玉米粉及作為氮源的蠅蛆利用效率明顯高于其他材料，相應對小菜蛾毒力也優(yōu)于其他發(fā)酵培養(yǎng)基配方；Bt20對同樣作為氮源魚粉利用效率卻不高，如發(fā)酵配方1（不含有蠅蛆）發(fā)酵液OD值為1.0683，是最優(yōu)配方3（不含魚粉）OD值1.4433的7/10倍，配方1的LC50為4.37× 104cfu·mL-1是配方3的LC50為2.11×104cfu·mL-1的2倍；對小菜蛾毒力試驗結果表明，配方3稀釋3 200倍發(fā)酵液在72 h校正死亡率為84.74%，而配方1稀釋3 200倍的發(fā)酵液在72 h的校正死亡率僅為62.74%，殺蟲毒力明顯比配方3低。這可能是由于蠅蛆自身蛋白質含量、各氨基酸比例及所含礦物質更適合被Bt20菌株利用，為Bt20菌株發(fā)酵培養(yǎng)基提供充足氮源。研究者為降低成本、減少浪費，對Bt發(fā)酵培養(yǎng)基組分進行大量研究，目前有利用農業(yè)廢棄物、工業(yè)廢水污泥等培養(yǎng)Bt，如：用雞糞上清液、淀粉廠廢水[16]、大豆粉+海水[17]等為原料培養(yǎng)Bt，其產胞量分別為2.46×108、2.90× 108、5.20×108cfu·mL-1，本配方產胞量為5.92×108cfu·mL-1，說明蠅蛆相比于廢水等能更有效被Bt利用。

陳在佴等研究表明，對蘇云金桿菌99-11菌株發(fā)酵影響最顯著的是碳源（玉米淀粉），其次是氮源（酵母粉）影響[18]；吳繼星等研究各因素對蘇云金桿菌79007菌株發(fā)酵影響順序為：葡萄糖＞添加劑＞玉米漿＞淀粉＞豆餅粉＞蛋白胨＞酵母粉，其中碳源（葡萄糖）的影響最大[19]；高鶴永等利用正交法優(yōu)化Bt發(fā)酵培養(yǎng)基，得到影響發(fā)酵主要因素為碳源（玉米粉）＞氮源（豆餅粉）＞氮源（花生餅粉）[20]。本研究也發(fā)現(xiàn)Bt20對作為碳源的玉米粉利用效率高于氮源，但與袁志明等研究中氮源對Bt發(fā)酵菌數(shù)影響要優(yōu)于碳源結果[21-22]不一致。這說明不同蘇云金桿菌亞種對不同類型碳源和氮源利用能力不一樣[5]；不同來源的同種原料，其營養(yǎng)成分及配比均不同，對Bt菌株發(fā)酵有影響[23]。

從發(fā)酵成本上看，由于魚粉是傳統(tǒng)優(yōu)質蛋白，被廣泛應用于Bt發(fā)酵原材料中，但價格昂貴，約為10 300～10 400元·t-1，使用受限。而本試驗表明Bt20對蠅蛆利用效率明顯高于魚粉，價格低廉約5 000～7 500元·t-1，是魚粉價格1/2～7/10倍，即生產每升Bt發(fā)酵液，需要0.84元，其綜合成本低于以魚粉為氮源的配方，更利于應用推廣。

從發(fā)酵時間上看，本研究優(yōu)化配方發(fā)酵時間76 h，較一般Bt發(fā)酵時間長（48 h）[24]，說明該配方營養(yǎng)物質豐富，使Bt20菌株進入對數(shù)生長期后，仍能獲得滿足其生長所需營養(yǎng)物質，繼續(xù)積累Bt20的菌體數(shù)量，提高其產量[25]。

從發(fā)酵機制上看，本研究僅是在室內搖瓶條件下對Bt20的配方進行優(yōu)化，與實際發(fā)酵罐生產存在一定差別。①本研究實通過添加Tris-HCl緩沖液及CaCO3對發(fā)酵液的初始pH進行控制，相比于發(fā)酵罐，無法實時檢測發(fā)酵過程中pH變化，無法確保發(fā)酵進程順利進行。②本研究采用一次性投料發(fā)酵，底物濃度較高，會抑制發(fā)酵進程，導致發(fā)酵時間較長，發(fā)酵罐采用分批補料發(fā)酵方式避免過多底物對發(fā)酵過程抑制，能縮短發(fā)酵時間。③本研究搖瓶培養(yǎng)溶氧量較發(fā)酵罐機械攪拌溶氧量低，而Bt是好氧型微生物，發(fā)酵罐效果更好[26]。本研究中所得配方為利用發(fā)酵罐規(guī)?；a提供數(shù)據(jù)支持，可利用發(fā)酵罐的實時在線監(jiān)測系統(tǒng)對該配方的原材料配比、pH變化、通氣量進一步優(yōu)化，為Bt規(guī)?；唐坊a奠定基礎。

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Optimization of fermentation conditions forBacillus thuringiensisstrain Bt20

ZHAO Kuijun1,XING Yanan1,HAN Lanlan1,SUN Wenpeng2,ZHANG Hongyu1,LI Ran1,HAN Xiaoxu1(1.School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2. HeilongjiangAgriculture Vocational and Techical College,Jiamusi Heilongjiang 154007,China)

Bacillus thuringiensisstrain Bt20 isolated in our laboratory with independent intellectual property right,had a high insecticidal activity that lepidopteran larvae and possess better popularization and application value.In this paper,we studied that how to optimize the carbon source and nitrogen source materials of Bt20 strain liquid fermentation medium,with the strain Bt20 fermentation broth absorbance value and the virulence against the 2nd instar larvae ofPlutella xylostellaas indices.Firstly,the single factor tests was performed to optimize the carbon source and nitrogen source materials of strain Bt20 liquid fermentation medium,the obtained optimal carbon source material and nitrogen source materials were the corn flour and the maggot,yeast flour,fish meal,soybean flour,respectively.Secondly,the orthogonal test was performed to the optimal carbon and nitrogen source materials.Experimental results showed that the appropriate formula of liquid fermentation medium was 3.0%corn flour,3.0%maggot,3.0%soybean flour and 2.0% yeast flour.Absorbance value of the optimal fermentation medium was 1.4733 and corrected mortality was 98.31%against the 2nd instar larvae ofPlutella xylostella,after 3 d.The optimal fermentation medium wassignificantly better than the fish meal fermentation broth which the absorbance value was 1.0683 and corrected mortality was 88.14%.The optimized formula can improve the yield and virulence of fermentation products,reduce production costs,and provide fundamental basis for the commercialization and large-scale application of Bt20.

Bacillus thuringensisBt20;fermentation condition optimization;optimal fermentation medium

S476

A

1005-9369（2014）07-0045-09

時間2014-7-4 17:18:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140707.0843.007.html

趙奎軍,邢亞楠,韓嵐嵐,等.蘇云金芽胞桿菌Bt20菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].東北農業(yè)大學學報,2014,45(7):45-53.

Zhao Kuijun,Xing Yanan,Han Lanlan,et al.Optimization of fermentation conditions forBacillus thuringiensisstrain Bt20[J]. Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(7):45-53.(in Chinese with English abstract)

2014-01-13

現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項（CARS-04）；公益性行業(yè)（農業(yè)）專項資助（201103002）；國家級大學生創(chuàng)新訓練項目（201210224002）

趙奎軍（1960-），男，教授，博士，博士生導師，研究方向為農業(yè)昆蟲與害蟲防治。E-mail：kjzhao@163.com