加列西·馬那甫，德娜·吐熱汗，李俊芳

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)數(shù)理學(xué)院，烏魯木齊 830052）

VC清除醬油亞硝酸鹽的響應(yīng)面優(yōu)化

加列西·馬那甫1，德娜·吐熱汗2，李俊芳1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)數(shù)理學(xué)院，烏魯木齊 830052）

以醬油為原料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取VC濃度、反應(yīng)溫度、pH為自變量，以亞硝酸鹽清除率為響應(yīng)值，采用3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，得到二次多項(xiàng)式回歸方程預(yù)測模型，優(yōu)化醬油中亞硝酸鹽的清除條件?；貧w預(yù)測模型具有高度顯著性，方程對試驗(yàn)擬合較好，可對醬油亞硝酸鹽清除率進(jìn)行分析和預(yù)測；響應(yīng)面圖表明，交互項(xiàng)對清除率影響不顯著，與回歸模型交互項(xiàng)P值的分析結(jié)果一致。VC清除醬油亞硝酸鹽的最佳條件為VC濃度0.48 μg·mL-1、反應(yīng)溫度46.08℃、pH 2.38。在最佳條件下,醬油亞硝酸鹽清除率可達(dá)52.4%，實(shí)測值為53.7%，兩者較接近，擬合性良好，表明Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理結(jié)合響應(yīng)面法，優(yōu)化醬油亞硝酸鹽清除降解條件可行。

醬油；亞硝酸鹽；VC；清除；響應(yīng)面分析法

醬油是傳統(tǒng)調(diào)味品，原料主要來自大豆和小麥，經(jīng)微生物酶轉(zhuǎn)化釀造而成[1]。近年來廣泛使用的含氮農(nóng)藥、化學(xué)氮肥及含氮工業(yè)廢水、廢渣對環(huán)境土壤和水造成污染，導(dǎo)致醬油硝酸鹽含量增加，在釀造過程中硝酸鹽易被還原為致癌物質(zhì)強(qiáng)氧化物亞硝酸鹽，增加亞硝酸鹽含量[2]。亞硝酸鹽作為發(fā)色劑在食品中允許限量使用，因此對食品中亞硝酸鹽控制涉及食品安全領(lǐng)域[3]。VC作為抗氧化劑具有較好自由基抑制、抗老化功能和清除亞硝酸鹽作用。在食品制作過程中加入少量VC可降低亞硝酸鹽含量，可有效阻斷亞硝酸鹽與仲胺類物質(zhì)作用合成亞硝胺[4]。VC與亞硝酸鹽物質(zhì)的量比為2∶1時，清除率可達(dá)100%[5]。本試驗(yàn)加入亞硝酸鈉與VC質(zhì)量比為5∶1時，亞硝酸鹽含量約降低5%，雖是按照反應(yīng)比例加入，試驗(yàn)樣品可能含其他氧化性物質(zhì)與VC反應(yīng)，同時氮在氧化還原反應(yīng)中價態(tài)隨反應(yīng)物濃度、條件、物質(zhì)的量而變化，按反應(yīng)式很難顯現(xiàn)出VC對醬油亞硝酸鹽最佳清除效果，表明進(jìn)一步研究優(yōu)化試驗(yàn)條件的重要性[6]。本文在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法[7]研究VC濃度、反應(yīng)溫度、pH對醬油亞硝酸鹽清除率影響[8]，建立最佳清除條件與清除率間的數(shù)學(xué)模型，確定醬油亞硝酸鹽最佳清除條件，在該條件下取得醬油亞硝酸鹽最佳清除率，為開發(fā)有效實(shí)用亞硝酸鹽天然清除劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆地產(chǎn)釀造醬油（購于烏魯木齊市某超市，生產(chǎn)日期：20130608，氨基酸態(tài)氮不低于0.4 g·100 mL-1）；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硼砂、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、VC、鹽酸，以上化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取醬油樣品10 g，置于500 mL燒杯中，加25 mL飽和硼砂溶液，攪拌均勻，加水150 mL，于沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫，加入10%亞鐵氰化鉀溶液10 mL，搖勻，再加入22%乙酸鋅溶液10 mL，沉淀蛋白質(zhì)；加水至刻度，搖勻，放置30 min，除去上層脂肪，過濾棄去清液初濾液30 mL。濾液備用于醬油中亞硝酸鹽的測定試驗(yàn)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

根據(jù)GB/T5009.33-2010要求建立亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=0.00073x+0.00327，R2= 0.9984。

1.2.3 樣品中亞硝酸鹽的測定

參見文獻(xiàn)[7]對醬油中亞硝酸鹽含量進(jìn)行測定。

1.2.4 清除亞硝酸鹽試驗(yàn)

精取5 mL樣品濾液，置于25 mL比色管中，加1 μg·mL-1VC溶液9.6 mL，加水定容至20 mL，搖勻，水浴40℃，調(diào)pH 2.0，反應(yīng)1 h；加0.2%對氨基苯磺酸溶液2 mL，搖勻，靜置5 min，加入0.02%鹽酸萘乙二胺溶液1 mL，加水至20 mL，混勻，靜置15 min，在538 nm波長處測定吸光度值。按下式計(jì)算清除率。

式中，A0-未加樣品溶液時NaNO2吸光度值；A-加入樣品溶液后NaNO2吸光度值。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

分別考查VC濃度（μg·mL-1）、反應(yīng)溫度（℃）和pH 3個因素對醬油亞硝酸鹽清除率影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 VC濃度對亞硝酸鹽清除率的影響

吸取5 mL已處理好的樣品濾液，反應(yīng)溫度和pH不變，VC濃度分別為0.12、0.24、0.36、0.48、0.60和0.72 μg·mL-1時，考查VC對醬油亞硝酸鹽清除率影響。當(dāng)VC濃度為0.48 μg·mL-1時，對亞硝酸鹽清除率最高，可達(dá)52.4%，因此選擇VC濃度為0.48 μg·mL-1，如圖1所示。

圖1 VC濃度對醬油亞硝酸鹽清除率的影響Fig.1 Effects of concentration of VC on the soy sauce nitrite clearance rate

由圖1可知，隨VC濃度增加，VC對醬油中亞硝酸鹽清除率呈規(guī)律性變化。開始時隨VC濃度增加而快速上升，當(dāng)加入VC濃度達(dá)0.48 μg·mL-1時，VC清除率達(dá)52.4%，表明VC能有效清除醬油中亞硝酸鹽。這是因?yàn)閂C酸性來自烯二醇的羥基，由于羥基和羰基相鄰，烯二醇基極不穩(wěn)定，可與各種金屬反應(yīng)成鹽，解離出H+，而H+能與NO2-反應(yīng)，消耗NO2-，從而降低亞硝酸鹽含量。

2.1.2 反應(yīng)溫度對亞硝酸鹽清除率的影響

吸取5 mL已處理好的樣品濾液，VC濃度和pH不變，反應(yīng)溫度分別為20，30，40，50，60和70℃時。當(dāng)溫度為40℃時，VC對亞硝酸鹽清除率最高，可達(dá)45.0%，因此選擇反應(yīng)溫度為40℃，如圖2所示。

由圖2可知，隨反應(yīng)溫度提高，VC對醬油中亞硝酸鹽清除率呈規(guī)律性變化，起初隨VC濃度增加而快速上升，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)40℃時，VC清除率達(dá)52.4%，之后隨著反應(yīng)溫度的升高其清除能力下降，表明反應(yīng)溫度對VC清除醬油中的亞硝酸鹽有較大影響。因?yàn)闇囟仍?0℃時，VC和亞硝酸根的反應(yīng)活化能最高，反應(yīng)程度最高，對亞硝酸根的清除率也最高。

2.1.3 pH對亞硝酸鹽清除率的影響

吸取5 mL已處理好的樣品濾液，VC濃度和反應(yīng)溫度不變，pH分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0時。當(dāng)pH 2.0時，VC對亞硝酸鹽清除率最高，可達(dá)47.1%，因此選擇pH 2.0，如圖3所示。

圖2 反應(yīng)溫度對醬油亞硝酸鹽清除率的影響Fig.2 Effects of reaction temperature on the soy sauce nitrite clearance rate

圖3 pH對醬油亞硝酸鹽清除率的影響Fig.3 Effects of pH on the soy sauce nitrite clearance rate

由圖3可知，酸性條件下VC表現(xiàn)出較高清除能力，在pH 2.0時，VC對醬油中亞硝酸根清除能力為47.1%，而在pH 6.0時，其清除能力僅為8%。因?yàn)閂C含有特殊烯醇式結(jié)構(gòu)，隨pH升高VC很容易脫氫變成脫氫VC，脫氫VC在水溶液中其C1和C4位置上形成的內(nèi)酯環(huán)被打開，轉(zhuǎn)變成2，3-二酮古龍酸后完全失去活性。

2.2 醬油亞硝酸鹽清除條件的參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在前面單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以VC濃度（A）、反應(yīng)溫度（B）和pH（C）3個因素為自變量，亞硝酸鹽清除率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1、2。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factor and levels in Box-Behnken design

2.2.2 模型建立與方差分析

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，利用SAS 9.1.3軟件，對表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，可得VC濃度、反應(yīng)溫度和pH與醬油亞硝酸鹽清除率的二次多元回歸方程為：

式中，A、B、C在設(shè)計(jì)中均經(jīng)過量綱線性編碼處理，各項(xiàng)系數(shù)的絕對值大小直接體現(xiàn)出各因素對響應(yīng)值的影響程度大小，系數(shù)的正負(fù)反映影響方向。

對表2中試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到的方差分析結(jié)果如表3所示。

由表3可知，回歸方程中各變量對響應(yīng)值影響顯著性，由F檢驗(yàn)來判定，概率P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。由方差分析表可知，方程模型F值為93.21%，P＜0.05，表明回歸模型顯著：失擬項(xiàng)F值為6.52，P值為0.1358＞0.05，表明失擬項(xiàng)相對于絕對誤差不顯著，說明該回歸方程對試驗(yàn)擬合情況較好。各因素中一次項(xiàng)C極顯著，B顯著，A不顯著；二次項(xiàng)中B極顯著，A顯著，C不顯著；交互項(xiàng)不顯著，由此可見，各具體試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

為觀察某兩個因素及其交互作用同時對提取率的影響，將其他因素條件保持不變，獲得某兩個因素及其交互作用對提取率影響的一元二次方程，響應(yīng)面及其等高線圖圖4，確定因素最佳水平范圍。

圖4 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour line curves of various factors

響應(yīng)曲面坡度的平緩與陡峭程度，表明在處理?xiàng)l件發(fā)生變異時醬油亞硝酸鹽清除率的響應(yīng)靈敏程度，如果響應(yīng)曲面坡度相對平緩，表明響應(yīng)值（清除率）對處理?xiàng)l件不敏感；反之，響應(yīng)值敏感。等高線的形狀如果為橢圓形，表示兩因素交互作用顯著。由圖4可知，醬油亞硝酸鹽的清除中VC濃度與反應(yīng)溫度、VC濃度與pH、pH與反應(yīng)溫度交互作用不顯著，與表3中交互項(xiàng)P值的分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，建立VC對醬油亞硝酸鹽清除率的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。優(yōu)化VC清除亞硝酸鹽的最佳條件：VC濃度0.48 μg·mL-1，反應(yīng)溫度46.08℃，pH 2.38。在此條件下實(shí)際測定清除率可達(dá)52.4%，與模型預(yù)測值53.7%基本相符。且此方法具有安全無毒、成本低、清除率高、操作簡單等特點(diǎn)，可為進(jìn)一步研究VC在抗氧化食品、藥品、化妝品中的應(yīng)用以及藥理學(xué)研究提供理論依據(jù)。

[1]徐偉麗,單毓娟,張?zhí)m威,等.醬油摻假檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國調(diào)味品,2013,38(11):103-105.

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Optimization of nitrite clear in sauce by VC using response surface methodology

JIALIEXI·Manafu1,DENA·Turehan2,LI Junfang1(1.School of Chemical Engineering Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China;2 School of Mathematics and Physics,XinjiangAgricultural University,Urumqi 830052,China)

Soy sauce was regard as raw material,on the basis of single factor test,The paper chosed effect of concentration of VC,reaction temperature,pH as dependent variable,and chosed scavenging rate of nitrite as response value.According to the responsed surface Box-Benhnken experimental design principle,the simulation prediction model of two order polynomial equation was observed with three factors and three levels method to optimizing the clear conditions of nitrite in sauce.The regression prediction model was highly significant and the equation fitting to the test preferably,and also could analyze and forecast on nitrite scavenging rate in soy sauce.The response surface plots showed that the VC concentration with reaction temperature,VC concentrationed with pH,pH with reaction temperature interacts was not significant.This also was consistent to the analysis results of thePvalue of regression model interactiveterm.The optimum conditions for VC clear the nitrite in sauce,VC concentration was 0.48 μg·mL-1, reaction temperature was 46.08℃,pH was 2.38.Under the optimal conditions,the nitrite clear rate in saucecould reach to 50.1%,the measured value was 52.4%,which was close to each other and the fitting was good,this test showed that the Box-Behnken center-united experimental design principle with response surface method was feasible to optimize the clear conditions of nitrite in soy sauce.

soy sauce;nitrite;VC;clear;response surface methodology

R284.2

A

1005-9369（2014）07-0124-05

時間2014-7-7 8:20:48 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140707.0843.016.html

加列西·馬那甫,德娜·吐熱汗,李俊芳.VC清除醬油亞硝酸鹽的響應(yīng)面優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(7):124-128.

Jialiexi·Manafu,Dena·Turehan,LI Junfang.Optimization of nitrite clear in sauce by VC using response surface methodology[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(7):124-128.(in Chinese with English abstract)

2014-03-22

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)校前期項(xiàng)目（XJAU201302）

加列西·馬那甫（1964-），男，副教授，研究方向?yàn)閷?shí)用藥物分析。E-mail：jialiexi@sina.cn