崔芳芹 胡明跡 趙云霞 賈雪梅

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，安徽233030；2蚌埠市第二人民醫(yī)院骨科，安徽233000；3安徽醫(yī)科大學(xué)組織與胚胎學(xué)教研室，合肥230032）

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）是一種多病因的代謝性疾病，其特點(diǎn)是慢性高血糖，伴隨著因胰島素分泌及（或）胰島素作用缺陷所引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。近年來糖尿病患病率急劇上升，已成為繼腫瘤、腦血管疾病之后的威脅人類健康的第三大殺手［1］。眾所周知，下頜下腺是三對(duì)大唾液腺之一，70%的唾液是由下頜下腺分泌的，屬于典型的外分泌腺。2型糖尿病患者有典型的口渴癥狀，其產(chǎn)生與糖尿病病理導(dǎo)致下頜下腺組織損傷和外分泌功能下降有關(guān)［2］。目前研究表明下頜下腺顆粒曲管（Granular convoluted tubule，GCT）上皮細(xì)胞可以產(chǎn)生數(shù)十種生物活性物質(zhì)，其中有些因子已完全達(dá)到激素的標(biāo)準(zhǔn)，這說明下頜下腺還有很重要的內(nèi)分泌作用［3］。研究證實(shí)糖尿病大鼠下頜下腺組織產(chǎn)生的胰島素（Insulin，INS）含量降低［4］，表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）濃度下降［5］，糖原代謝異常改變［6］，而細(xì)胞因子［7］、瘦素 （Leptin，Lep）及瘦素受體（Leptin－receptor，Lep－R）［8］隨糖尿病病程延長而表達(dá)增加。下頜下腺生物學(xué)功能減弱，可能與糖尿病時(shí)下頜下腺細(xì)胞增殖與凋亡失衡有關(guān)［9］，但具體發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。關(guān)于凋亡相關(guān)因子Bcl－2和Caspase－3表達(dá)變化與糖尿病大鼠下頜下腺細(xì)胞增殖與凋亡失衡之間的關(guān)系，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用鏈尿佐菌素（Streptozotocin，STZ）復(fù)制2型糖尿病大鼠模型并用胰島素對(duì)其進(jìn)行治療，取下頜下腺進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察胰島素對(duì)糖尿病大鼠下頜下腺Bcl－2和Caspase－3表達(dá)的影響，以期為深入探討B(tài)cl－2和Caspase－3在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用，及為早期使用胰島素治療2型糖尿病提供形態(tài)學(xué)根據(jù)。

材料和方法

1．試劑

Bcl－2和Caspase－3的抗體和SP免疫組化試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2．糖尿病動(dòng)物模型復(fù)制

雄性SD大鼠30只，體重（110－160g，普通級(jí)），隨機(jī)分為3組，10只大鼠予普通飼料喂養(yǎng)作為對(duì)照組（C組）；20只大鼠一次腹腔注射2%鏈尿佐菌素，35mg／kg，復(fù)制2型糖尿病模型，其中10只予普通飼料喂養(yǎng)作為糖尿病組（DM組）；另外10只大鼠予以胰島素治療（3u／d，皮下注射），普通飼料喂養(yǎng)作為胰島素治療組（INS組）；連續(xù)觀察2個(gè)月，各組動(dòng)物均不限制飲食和飲水。

3．標(biāo)本制備

用20%烏拉坦1ml／100g，腹腔注射，麻醉后剖開腹腔，迅速從腹腔靜脈抽5ml血送檢血糖、甘油三酯（Triglyceride，TG）和總膽固醇（Total cholesterol，TC）。取出下頜下腺，用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度為4μm）。

4．免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)SP法染色：①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)；②3%H2O2，37℃孵育15min；③山羊血清封閉，37℃孵育30min，勿洗；④一抗為兔抗鼠Bcl－2和Caspase－3抗體，稀釋濃度均為1∶100，4℃過夜；⑤二抗為生物素標(biāo)記的山羊抗兔的IgG，37℃孵育15min；⑥辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37℃孵育30min；⑦以上各步驟之間都PBS液沖洗3次×5min；⑧DAB顯色3min，自來水沖洗；⑨蘇木精復(fù)染2min，自來水沖洗，脫水，透明和封片。用PBS替代第一抗體作為陰性對(duì)照。

5．計(jì)算機(jī)圖像分析

在10×40倍光鏡下，利用Nikon彩色數(shù)碼CCD攝像頭捕獲各組免疫組化染色切片中Bcl－2和Caspase－3的圖像，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，再用metamorph生物圖像軟件計(jì)算各組Bcl－2和Caspase－3免疫陽性細(xì)胞的平均光密度值（MOD）。

6．?dāng)?shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13．0軟件進(jìn)行處理，分析各組Bcl－2和Caspase－3免疫陽性細(xì)胞的平均光密度值（MOD），結(jié)果均用（ˉx±s）表示，組間差異采用q檢驗(yàn)，P＜0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．血糖結(jié)果

DM組血糖分別與C組和INS組血糖比較，均有顯著性差異（P＜0．05）；C組血糖與INS組血糖比較，無顯著性差異（P＞0．05）（表1）。

2．血脂結(jié)果

DM組TG分別與C組和INS組TG比較，均有顯著性差異（P＜0．05）；C組TG與INS組TG比較，無顯著性差異（P＞0．05）。DM組TC分別與C組和INS組TC比較，均有顯著性差異（P＜0．05）；C組TC與INS組TC比較，無顯著性差異（P＞0．05）（表1）。

表1 三組大鼠空腹血糖、TG和TC濃度（mmol／L）的比較（±s）Table 1 Comparision of the fasting blood glucose，TG and TC（mmol／L）of the rats in three groups（±s）

表1 三組大鼠空腹血糖、TG和TC濃度（mmol／L）的比較（±s）Table 1 Comparision of the fasting blood glucose，TG and TC（mmol／L）of the rats in three groups（±s）

注：與C組比較：＊P＜0．05；與DM組比較，＃P＜0．05。

組別 n（只） TG TC 血糖C組 10 0．7848±0．2127 1．2506±0．3539 4．1919±1．1668 DM 組 10 1．4951±0．5567＊ 9．6081±5．2476＊ 15．4700±7．1032＊INS組 10 0．8382±0．4921＃ 3．6283±0．7274＃ 5．8513±1．8247＃

3．免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

C組大鼠下頜下腺組織切片中，Bcl－2免疫反應(yīng)強(qiáng)陽性物主要沉積在顆粒曲管（GCT）導(dǎo)管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色至棕褐色不等，細(xì)胞核及腺泡呈陰性反應(yīng)（圖1A）；與C組比較，DM組Bcl－2表達(dá)顯著減少，呈弱陽性，淺棕色（圖1B）；與DM組比較，INS組Bcl－2表達(dá)增強(qiáng)，呈中等強(qiáng)陽性，棕黃色（圖1C）。C組大鼠下頜下腺組織切片中，Caspase－3免疫反應(yīng)弱陽性物主要沉積在顆粒曲管導(dǎo)管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈淺棕色，細(xì)胞核及腺泡呈陰性反應(yīng) （圖2A）；與C組比較，DM組Caspase－3表達(dá)增強(qiáng)呈強(qiáng)陽性，棕褐色（圖2B）；與DM 組比較，INS組Caspase－3表達(dá)顯著減弱呈弱陽性，淺棕色至棕黃色不等（圖2C）。

4．計(jì)算機(jī)圖像分析結(jié)果

C組大鼠下頜下腺Bcl－2和Caspase－3的MOD值分別與 DM 組Bcl－2和Caspase－3的 MOD值比較，均有差異性（P＜0．05）；DM 組與INS組Bcl－2和Caspase－3的 MOD值比較，均有差異性（P＜0．05）；C 組 Bcl－2 和 Caspase－3 的 MOD 值 分 別 與INS組比較，均無差異性（P＞0．05）（表2）。

表2 三組大鼠Bcl－2和Caspase－3平均光密度值（MOD）的比較（ˉx±s）Table 2 Comparision of MOD of Bcl－2and Caspase－3in the submandibular glands of the rats in three groups±s）

表2 三組大鼠Bcl－2和Caspase－3平均光密度值（MOD）的比較（ˉx±s）Table 2 Comparision of MOD of Bcl－2and Caspase－3in the submandibular glands of the rats in three groups±s）

注：與C組比較，＊P＜0．05；與DM 組比較，＃P＜0．05

組別 n Bcl－2 Caspase－3 C組10 0．2941±0．0181 0．2399±0．0202 DM 組 10 0．1969±0．0240＊ 0．3107±0．0274＊INS組10 0．2864±0．0219 0．2543±0．0166

討 論

目前認(rèn)為Bcl－2基因家族在凋亡中發(fā)揮重要作用，Bcl－2可以通過與Bax競爭結(jié)合形成異源二聚體，封閉Bax形成孔道的活性，阻止ctyc穿過線粒體膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而抵抗細(xì)胞凋亡［10］。Caspase－3又稱半胱氨酸蛋白酶32（Cysteine protease P32，CPP32），或稱為apopain，Caspase－3是參與凋亡Caspase級(jí)鏈反應(yīng)最終效應(yīng)子，在蛋白酶級(jí)聯(lián)切割過程中處于核心位置，不同的蛋白酶切割Caspase－3酶原，從而激活Caspase－3，活化的Caspase－3又進(jìn)一步切割不同的底物，導(dǎo)致蛋白酶級(jí)聯(lián)切割放大，最終使細(xì)胞死亡。Caspase－3是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，也是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，在凋亡的信息傳遞中居于核心地位［11］，是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵酶。Caspase－3的活化是細(xì)胞凋亡的早期生物化學(xué)指標(biāo)，并與細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)相互關(guān)聯(lián)［12］。

糖尿病是一種以全身性代謝紊亂為主的內(nèi)分泌疾病，糖尿病不僅能引發(fā)全身代謝紊亂，還可造成眼、腎臟、心血管、腦和神經(jīng)等多器官和多系統(tǒng)的慢性損害，后者是糖尿病患者致死、致殘的主要原因。隨著人們對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制的深入研究，糖尿病病理對(duì)下頜下腺生物學(xué)功能的影響已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。眾所周知，下頜下腺是三對(duì)大唾液腺之一，70%的唾液是由下頜下腺分泌的。研究表明糖尿病病理導(dǎo)致下頜下腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)及外分泌功能異常［2，13］，這可能是引起2型糖尿病口渴的重要原因之一。下頜下腺不僅具有外分泌腺的功能，它還是產(chǎn)生生物活性物質(zhì)種類最多的器官之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，下頜下腺所產(chǎn)生的有顯著生物活性物質(zhì)可達(dá)50多種，其中有些因子已完全達(dá)到激素的標(biāo)準(zhǔn)，這些生物活性物質(zhì)主要定位于GCT上皮細(xì)胞內(nèi)，它們直接分泌入血，或隨唾液進(jìn)入消化道再由胃腸吸收入血，在多種組織和細(xì)胞的生理活動(dòng)中起重要調(diào)節(jié)作用，因此，下頜下腺又具有內(nèi)分泌功能［3］。有研究發(fā)現(xiàn)EGF是下頜下腺產(chǎn)生的主要生物活性物質(zhì)之一，它廣泛作用于機(jī)體各組織和器官［14］。有報(bào)道顯示，在倉鼠下頜下腺GCT細(xì)胞胞質(zhì)中產(chǎn)生若干種細(xì)胞因子［15］，這意味著下頜下腺可能參與機(jī)體的免疫防御和免疫調(diào)節(jié)。賈雪梅等發(fā)現(xiàn)小鼠下頜下腺GCT細(xì)胞內(nèi)生長抑素呈免疫反應(yīng)陽性［16］，生長抑素的存在，對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)共存的其他神經(jīng)肽的釋放以及腺泡的分泌活動(dòng)可能具有一定的影響。下頜下腺還能分泌多種促細(xì)胞生長與分化因子［17］。有人將下頜下腺視為消化道彌散性神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的一部分，是具有內(nèi)分泌和外分泌雙重功能的腺體，因此對(duì)下頜下腺形態(tài)及功能研究具有重要臨床意義［18］。Patel研究STZ糖尿病小鼠模型時(shí)，發(fā)現(xiàn)下頜下腺內(nèi)胰島素含量與胰腺內(nèi)胰島素同時(shí)降低［4］，下頜下腺及血漿中的表皮生長因子濃度均下降，從而推測糖尿病導(dǎo)致EGF缺乏，繼而引起一系列其它的繼發(fā)性病理變化［5］。本課題組前期研究觀察到糖尿病大鼠下頜下腺的腺泡萎縮，細(xì)胞排列紊亂，GCT導(dǎo)管上皮細(xì)胞萎縮，局部結(jié)締組織明顯增多等病理變化［19］。但糖尿病大鼠下頜下腺GCT導(dǎo)管上皮細(xì)胞發(fā)生萎縮的病理機(jī)制尚不十分清楚，可能與細(xì)胞增值與凋亡失衡有關(guān)［9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DM組大鼠下頜下腺GCT導(dǎo)管上皮細(xì)胞Bcl－2表達(dá)較C組顯著減少（P＜0．05），而Caspase－3表達(dá)較C組顯著增強(qiáng)（P＜0．05），從而提示糖尿病時(shí)下頜下腺GCT導(dǎo)管上皮細(xì)胞凋亡活動(dòng)增強(qiáng)。Bcl－2和Caspase－3表達(dá)異常變化可能是導(dǎo)致GCT導(dǎo)管上皮細(xì)胞發(fā)生萎縮等退行性病變的重要機(jī)制之一，可能引起糖尿病下頜下腺生物學(xué)功能發(fā)生異常變化，并可能在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

胰島素是體內(nèi)唯一降低血糖的激素，且不會(huì)導(dǎo)致依賴性和成癮性；但長期以來，胰島素沒有得到及時(shí)、合理的應(yīng)用［20］。2型糖尿病是一種緩慢進(jìn)展性疾病，其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能缺陷。胰島素缺乏可造成脂肪代謝紊亂，使脂肪合成減少，分解代謝增加，導(dǎo)致血脂升高，進(jìn)而可引起動(dòng)脈硬化［21］等嚴(yán)重糖尿病并發(fā)癥。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)胰島素不僅能顯著減低糖尿病大鼠血糖、TG和TC濃度，還具有顯著促進(jìn)下頜下腺GCT細(xì)胞Bcl－2表達(dá)上調(diào)和Caspase－3下調(diào)的作用；因此早期應(yīng)用胰島素治療2型糖尿病，不僅能控制糖脂代謝紊亂，還能對(duì)抗糖尿病下頜下腺細(xì)胞凋亡，保護(hù)GCT上皮細(xì)胞的生物學(xué)功能，也可能在減輕糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮積極的保護(hù)作用。胰島素能上調(diào)Bcl－2和下調(diào)Caspase－3的表達(dá)，可能與胰島素具有降血糖、血脂的作用，從而減輕高血糖、高血脂對(duì)DM大鼠下頜下腺結(jié)構(gòu)損害；胰島素能增加全身組織細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，可促進(jìn)脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）及三磷酸腺苷（ATP）的合成；胰島素可促進(jìn)鉀離子和鎂離子穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，對(duì)組織細(xì)胞具有保護(hù)作用。然而，胰島素使糖尿病大鼠下頜下腺GCT導(dǎo)管上皮細(xì)胞內(nèi)Bcl－2表達(dá)下調(diào)和Caspase－3表達(dá)上調(diào)的具體機(jī)制尚不十分清楚，仍需下一步深入探討。

綜上所述，糖尿病大鼠下頜下腺GCT上皮細(xì)胞內(nèi)Bcl－2表達(dá)上調(diào) 和Caspase－3表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致糖尿病下頜下腺GCT細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，這可能為Bcl－2和Caspase－3在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用及意義提供形態(tài)學(xué)根據(jù)。胰島素具有抗糖尿病下頜下腺細(xì)胞凋亡的作用，也為臨床上早期應(yīng)用胰島素治療2型糖尿病提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

圖 版 說 明

圖1A C組大鼠下頜下腺GCT（↑）上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)Bcl－2免疫反應(yīng)呈強(qiáng)陽性，SP×400

圖1B DM組大鼠下頜下腺GCT（↑）上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)Bcl－2免疫反應(yīng)呈弱陽性，SP×400

圖1C INS組大鼠下頜下腺GCT（↑）上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)Bcl－2免疫反應(yīng)呈中等強(qiáng)陽性，SP×400

圖2A C組大鼠下頜下腺GCT（↑）上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)Caspase－3免疫反應(yīng)呈弱陽性，SP×400

圖2B DM組大鼠下頜下腺GCT（↑）上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)Caspase－3免疫反應(yīng)呈強(qiáng)陽性，SP×400

圖2C INS組大鼠下頜下腺GCT（↑）上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)Caspase－3免疫反應(yīng)呈弱陽性，SP×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1AStrong positive immuoreactivity of Bcl－2in epithelial cells of group Control，GCT （↑），SP×400

Fig．1BLower positive immuoreactivity of Bcl－2in epithelial cells of group DM，GCT （↑），SP×400

Fig．1CMiddle positive immuoreactivity of Bcl－2in epithelial cells of group INS，GCT （↑），SP×400

Fig．2ALower positive immuoreactivity of Caspase－3in epithelial cells of group Control，GCT （↑），SP×400

Fig．2BStrong positive immuoreactivity of Caspase－3in epithelial cells of group DM，GCT （↑），SP×400

Fig．2CLower positive immuoreactivity of Caspase－3in epithelial cells of INS group，GCT （↑），SP×400

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