王生級 吳 偉＊ 范曉婷 李延輝

（1中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院急診科；2遼寧省金秋醫(yī)院，沈陽110001）

糖尿?。―M）患者的心臟受各種病理的侵蝕，包括加速的動脈粥樣硬化，心臟自主神經(jīng)病變，內(nèi)在的心肌病變［1］。這種在糖尿?。―M）基礎(chǔ)上發(fā)生的心肌病變，稱其為糖尿病心肌?。―iabetic Cardiomyopathy，DCM），其發(fā)病機制中，DAG－PKC途徑過度激活起著樞紐作用，DAG－PKC通路的激活，被證明是早期引起糖尿病心功能失常的重要機制，本研究將在過去研究的基礎(chǔ)上以STZ誘導的糖尿病大鼠模型為基礎(chǔ)，深入探討早期糖尿病心肌病的病理變化，以及PKC－β2和JNK1的關(guān)系，觀察DCM發(fā)生發(fā)展的變化，為預(yù)防及治療糖尿病心肌病提供干預(yù)的理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1．實驗主要試劑

STZ（美國Sigma公司）、兔抗大鼠PKCβ2和兔抗大鼠JNK1（武漢博士德生物工程有限公司）、兔抗大鼠IRS1（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、Triozol Reagent（美國Invitrogen Life technologies公司）、熒光定量PCR試劑盒（大連寶生生物工程有限公司）。

2．糖尿病模型建立及分組

SPF級SD系大鼠60只，由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供，隨機分成對照組（C組）、糖尿病模型組（A組）與糖尿病LY333531（10mg·kg－1·d－1）灌胃給藥干預(yù)組（B組），每組各20只。

3．模型建立

正常飼養(yǎng)1w后，禁食24h，期間自由飲水，實驗組大鼠按60mg／kg鏈脲佐菌（STZ）溶液（臨用前用0．1mol／L檸檬酸緩沖液溶解，pH4．5）一次性左下腹腔注射，對照組注射等量檸檬酸緩沖液。72h后檢測尿糖、血糖情況，以空腹血糖＞11．1mmol／L，非空腹血糖＞16．7mmol／L，尿糖定性≥＋＋＋，動物多飲、多食和尿量增加者確定為DM模型。所有大鼠在整個實驗期間均喂標準飲食，自由飲水，不應(yīng)用胰島素，整個實驗觀察8w，飼養(yǎng)至相應(yīng)周數(shù)處死取材。

4．血糖及體重測定

采用羅氏Accu－CHEK．Active血糖儀，在禁食12h后，取大鼠尾末梢毛細血管全血測定空腹血糖。稱量大鼠體重。均為每周1次。

5．全心重量和左室重量的測定

在病程8w末分別從3組大鼠中隨機選擇10只，所有大鼠稱重后，用3%的戊巴比妥鈉2ml腹腔注射麻醉，剪開胸骨，暴露心臟，從主動脈根部水平離斷心臟，用冷生理鹽水充分沖洗后，濾紙吸干，稱重。分離左心室，稱重。分別計算心體比（全心重／體重，H／W）及左室指數(shù)（左室重／體重，left ventricular mass index，LVMI）。

6．心臟組織 HE

染色和心肌膠原纖維 Masson染色：病理標本用10%中性福爾馬林常規(guī)方法固定24h，逐級乙醇脫水，石蠟包埋，進行HE染色。采用顯微圖象分析系統(tǒng)（MetaMorp／DP10／BX41），每張切片選擇5個視野，測量膠原纖維染色陽性面積，并計算心肌膠原容積分數(shù)（CVF），公式如下：CVF%＝膠原面積／全視野面積×100%，并計算平均值。

7．電鏡觀察

將1mm3大小的心肌組織固定于2．5%戊二醛中，PBS漂洗，1%鋨酸固定，常規(guī)乙醇脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，超薄切片（70nm），醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，JME－1200EX電鏡觀察、拍片。

8．免疫組化分析

SABC法檢測JNK1、IRS－1、PKC－β2表達，采用形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)軟件，每張切片隨機檢測5個視野，然后計算每個標本的平均光密度值（MOD），以 MOD 作為JNK1、IRS－1、PKCβ2表達水平的半定量參數(shù)。

9．Real－Time PCR檢測JNK1mRNA 和IRS－1mRNA的表達

①參照Trizol說明書（Invitrogen公司）采取一步法提取總RNA，②RNA濃度和純度測定：取1μl RNA樣本，加79μl DEPC水，紫外分光光度計測OD260與 OD280，二者比值1．8－2．0提示樣本中RNA純度合格。（3）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：用試劑盒合成cDNA（北京華大基因公司），嚴格按照說明書進行。（4）PCR擴增：用上述引物進行實時定量PCR反應(yīng)，ABI 7500擴增儀（德國Biometra）。

10．統(tǒng)計學分析

采用SPSS13．0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，試驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，采用方差分析或t檢驗，P＜0．05表示差異有顯著意義。P＜0．01表示差異非常顯著。

結(jié) 果

1．一般指標變化

與C組相比，A組及B組血糖明顯升高（P＜0．01）、體重明顯降低（P＜0．01）、A組及B組血糖無明顯差異，B組體重高于A組（P＜0．05），A組及B組左室重、心體比、左室質(zhì)量指數(shù)明顯高于C組（P＜0．01，P＜0．01，P＜0．01），A組與B組間亦有明顯差異（P＜0．01，P＜0．01，P＜0．01）（見表1）。

表1 各組一般指標變化±s）Table 1 Values of FBG、BW、HW、LVH、H／B and LVMJ in rats

表1 各組一般指標變化±s）Table 1 Values of FBG、BW、HW、LVH、H／B and LVMJ in rats

注：與對照組比較：＃P＜0．01；與干預(yù)組比較：＊P＜0．01Compared with Group C：＃P＜0．01；Compared with Group B：＊P＜0．01

組別Group例數(shù)n空腹血糖FBG（mmol／L）體重BW（g）全心重HW（g）左室重量LVH（g）心體比H／B（10－3）左室質(zhì)量指數(shù)LVMJ（10－3）C組 10 7．00±1．1 312．5±17．08 0．84＋0．17 0．74＋0．04 2．7±0．06 2．37±0．02 A組 10 26．8±2．9＃ 203．8±4．79＃＊ 0．79±0．39＃＊ 0．59±0．02＃＊ 3．6±0．17＃＊ 2．94±0．07＃＊B組 10 27．9±1．2 247．5±18．9 0．73±0．18 0．61±0．05 3．2±0．13 2．49±0．01

2．心肌間質(zhì)纖維化評價

HE染色可見C組大鼠心肌排列整齊，橫紋肌清晰，A組細胞排列紊亂，有局灶性壞死，干預(yù)后有所改觀。Masson染色中膠原纖維呈藍綠色，肌纖維呈紅色。C組膠原分布均，A組心肌內(nèi)膠原纖維明顯增多、排列紊亂、分布不均，緊密圍繞心肌細胞及小血管周圍。B組心肌內(nèi)膠原纖維明顯減少，A組大鼠心肌膠原容積分數(shù)（CVF）和血管周圍膠原面積（PVCA）顯著增加，以PVCA增加更為顯著，約為正常的2．5倍，而CVF約為正常的2倍（表2，圖1，圖2）。

表2 各組心肌間質(zhì)纖維化指標變化（±s）Table 2 Changes of CVF and PCVA of rat in different groups

表2 各組心肌間質(zhì)纖維化指標變化（±s）Table 2 Changes of CVF and PCVA of rat in different groups

注：與C組比較：＃P＜0．01；與B組比較：＊P＜0．01Compared with Group C：＃P＜0．01；Compared with Group B：＊P＜0．01

組別 例數(shù) CVF（%） PCVA（%）C組10 3．19±0．57 7．15±1．06 A組 10 9．57±0．94＃＊ 18．32±4．41＃＊B組10 6．41±1．58 12．14±0．22

3．電鏡結(jié)果

C組大鼠心肌細胞含大量肌絲，肌絲排列規(guī)則，明暗帶清晰可見。線粒體正常，呈圓形或橢圓形，嵴發(fā)達明顯，排列密集。心肌細胞間可見閏盤連接，排列整齊。A組心肌細胞內(nèi)肌原纖維含量明顯減少，肌絲排列紊亂、稀疏，部分肌絲斷裂、扭曲，局部溶解，喪失，明暗帶不明顯。線粒體排列紊亂，部分線粒體腫脹明顯，嵴變寬、斷裂、甚至消失，線粒體基質(zhì)密度下降，且內(nèi)形成空泡。干預(yù)后，心肌細胞肌原纖維含量較糖尿病組有所增加，肌絲排列整齊，線粒體輕度腫脹，嵴間隙略有增寬，部分融合斷裂，線粒體內(nèi)空泡結(jié)構(gòu)減少（圖3）。

4．免疫組化結(jié)果

各組圖片使用顯微圖象分析系統(tǒng)（MetaMorp／DP10／BX41）進行光密度值分析，結(jié)果顯示，A組PKCβ2、JNK1、p－JNK、IRS1平均光密度值（MOD）明顯高于C組，B組較A組表達減少，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）（表3，圖4－圖8）。

表3 各組大鼠心肌PKC、JNK、P－JNK、IRS－1的平均光密度值（MOD）比較（ˉx±s）Table 3 The average optical density of pkc、JNK、P－JNK、IRS－1of rat in different groups

5．Real－Time PCR 結(jié)果

C組大鼠心肌少量表達JNK1mRNA和IRS1mRNA，而A組大鼠心肌則顯著升高，是C組的30倍 和20倍（P＜0．01）。干 預(yù) 后，大 鼠 心 肌JNK1mRNA和IRS－1mRNA的表達水平明顯下調(diào)。

討 論

關(guān)于糖尿病心肌病發(fā)病機制的研究，以往主要集中在心肌細胞的代謝，鈣離子轉(zhuǎn)運以及氧自由基異常等，有關(guān)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導和細胞功能調(diào)節(jié)在糖尿病心肌病中的研究越來越受到重視，其發(fā)病機制中，DAG－PKC途徑過度激活起著樞紐作用，PKC的激活，被證明是早期引起糖尿病心功能失常的重要機制［2］，PKC是由甘油二酯激酶亞型（DGKζ）控制大鼠心肌細胞DAG水平（將DAG分解成磷脂酸PA）來調(diào)節(jié)DAG－PKC的下游級聯(lián)信號。對佐菌素（STZ）誘導的T1DM小鼠心肌細胞進行研究，發(fā)現(xiàn)PKCβ和δ亞型從胞漿易位到胞膜與減少心臟泵血功能和提高間質(zhì)纖維化有因果聯(lián)系；而在轉(zhuǎn)DGKζ基因DM小鼠，PKCβ和δ亞型從胞漿易位到胞膜明顯減少，并且沒有出現(xiàn)明顯的左室收縮功能障礙以及心肌纖維化［3］。本研究發(fā)現(xiàn)PKCβ2在糖尿病組大鼠心肌中大量表達，明顯高于對照組和干預(yù)組。而高選擇性PKCβ2抑制劑LY333531的初步應(yīng)用也進一步確定了PKCβ2在糖尿病微血管病變中的作用［4］，對于眾多的PKC同工酶，它們在心肌重塑中可能發(fā)揮不同的角色，其中PKCβ2可能激活c－jun N端蛋白激酶1（JNK1），從而影響到下游的信號［6－8］。

本研究結(jié)果顯示，與C組相比，A組JNK1、PJNK1、IRS－1的表達明顯升高（P＜0．01），干預(yù) DAGPKC通路后，其表達相應(yīng)減少。激活的JNK1不僅在絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉(zhuǎn)導通路中起作用，且能磷酸化胰島素受體底物1（IRS－1），而IRS－1是受胰島素（Isulin）或胰島素樣因子（IGF－1）刺激，這樣JNK1就能對Insulin／IGF－1的IRS－1通路起到調(diào)節(jié)作用，即IRS－1激活磷酸肌醇3激酶（PI3K），PI3K進一步通過激活絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶／蛋白激酶B（Akt／PKB）通路，造成心肌肥厚和心臟衰竭［9］，而最新研究發(fā)現(xiàn)，在 Akt／PKB通路中，通過磷酸化mOTRser2448，影響哺乳動物雷帕霉素靶點（mOTR）作用，而其中的途徑很復(fù)雜，目前還不清楚，只能了解到其中的一個效應(yīng)是mOTRser2448受到磷酸化，從而激活了核糖體蛋白S6激酶1（p70S6K1），激活的p70S6 K1促進了缺氧誘導因子1（HIF1）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的生成，加快了心肌肥厚［10－12］。

綜上，DAG－PKC通路可能通過G蛋白受體和胰島素受體途徑的共同信號點JNK1影響下游的信號傳導而導致糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展，DAG－PKCJNK1－IRS1－Akt／PKB－mTOR－p70S6K1等一 系列信號位點可能是DAG－PKC信號轉(zhuǎn)導通路引起糖尿病心肌病可能的潛在途徑。目前我們面臨的挑戰(zhàn)是如何控制糖尿病心肌病發(fā)生的內(nèi)在危險因素，現(xiàn)在仍有許多有待解決的問題。如果明確了糖尿病心肌病的發(fā)生機制，并采取針對性的干預(yù)措施，必將降低糖尿病心肌病的發(fā)病率和提高患者的生存質(zhì)量。

圖 版 說 明

圖1 各組大鼠心肌組織masson染色結(jié)果（×400）

圖2 各組大鼠心肌小血管周圍masson染色結(jié)果（×400）

圖3 各組大鼠心肌細胞組織透射電鏡結(jié)果（×15000）

圖4 各組大鼠心肌組織PKCβ2蛋白陽性表達（免疫組化×200）

圖5 各組大鼠心肌組織JNK1蛋白陽性表達（免疫組化×200）

圖6 各組大鼠心肌組織p－JNK1蛋白陽性表達（免疫組化×200）

圖7 各組大鼠心肌組織IRS1蛋白陽性表達（免疫組化×200）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1Masson staining result of myocardium of rats in each group（×400）

Fig．2Masson staining result of tissue around small vessels in myocardium of rats in each group（×400）

Fig．3Transmission electron microscope changes of myocardial cell of rats in each group（×15000）

Fig．4Positive expression of PKC？劆？Ⅱin myocardium of rats in each group（immunohistochemisttry，×200）

Fig．5Positive expression of JNK1in myocardium of rats in each group（immunohistochemisttry，×200）

Fig．6Positive expression of p－JNK1in myocardium of rats in each group（immunohistochemisttry，×200）

Fig．7Positive expression of IRS1in myocardium of rats in each group（immunohistochemisttry，×200）

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