繆化春 吳 鋒 丁 見 熊克仁

（皖南醫(yī)學院解剖學教研室，蕪湖241002）

目前的研究已證實海馬CA3區(qū)是腦缺血的耐受區(qū)［1］，腦缺血可通過誘導海馬結構巢蛋白（Nestin）的表達，激活內源性神經干細胞（neural stem cells，NSCs），并使其向損傷區(qū)域移位從而發(fā)揮神經再生作用，而在腦缺血后CA3區(qū)錐體細胞分泌的腦源性神經營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）的表達在腦缺血后14d時明顯增多，對中樞神經系統(tǒng)再生和修復起重要作用［2，3］。電針能促進腦缺血大鼠內源性NSCs的增生和分化，從而促進大鼠神經功能康復，中藥天麻中的重要活性成分 天 麻 多 糖 （Polysaccharide of Gastrodia elata Blume，PGB）可促進神經組織的恢復，但機制尚不完全清楚［4，5］。電針聯(lián)合PGB對腦缺血大鼠海馬CA3區(qū)Nestin和BDNF的影響如何，尚未見報道。本實驗對此進行研究，并對針藥結合與單純的藥物、電針之間的療效進行比較，以探討PGB及電針聯(lián)合PGB對腦缺血后損傷修復的作用及可能機制。

材料和方法

1．動物與分組

SD成年雄性大鼠40只，體重（200±20）g，由浙江省實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（浙）－2008－0033。將大鼠隨機分為正常對照組、模型組、天麻多糖組、電針組和針藥結合組，每組8只。

2．主要試劑及儀器

兔抗Nestin、兔抗BDNF及SABC免疫組化試劑盒（均為博士德公司），低頻電子脈沖治療儀（上海醫(yī)用電子儀器廠，型號G6805－2），黑馬病理圖像分析儀（型號 Hema GSM－2000P，深圳）。

3．天麻多糖的提取

新鮮天麻洗凈后去皮，切成片狀，用勻漿機制成糊狀，按參考文獻［6］方法，采用水提醇沉提法得天麻粗多糖，再經過DEAE纖維素柱過柱分離，得到PGB。

4．造模方法

參照Zea Longa等［7］建立大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）腦缺血動物模型。大鼠經戊巴比妥鈉30 mg／kg腹腔注射麻醉后仰臥位固定，頸部正中切開皮膚，鈍性分離各層組織，暴露右側頸總動脈。分離至頸內動脈、頸外動脈，將頸內動脈近心端扎緊，將尼龍線置入套管針，由頸內動脈插入，插入后用0號絲線結扎，將套管針抽出，繼續(xù)插入至顱內，插入深度約18．5±0．5mm至微感阻力，使尼龍線頭端通過大腦中動脈起始處，到達較細的大腦前動脈，結扎頸內動脈以固定尼龍線和防止出血，逐層縫合，尼龍線殘端留lcm長于皮外。造模成功大鼠用于實驗。

5．治療方法

造模后2w，天麻多糖組和針藥結合組大鼠分養(yǎng)，給予天麻多糖100mg／kg灌胃，每天1次，連續(xù)2w；電針組和針藥結合組大鼠，以30號1寸毫針刺“百會”“足三里”穴，針柄連接至電針儀，給予低頻（2Hz）電流刺激，強度為3V，波寬為1ms，持續(xù)30min，每天1次，連續(xù)2w；電針時以大鼠后趾輕微抖動為度，無劇烈掙扎、嘶叫。實驗過程中對動物的處置符合有關善待實驗動物的規(guī)定。

6．免疫組織化學方法

實驗完成后，大鼠用30mg／kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，暴露心臟，經左心室－升主動脈插管灌注固定。先快速灌注溫生理鹽水100ml，再灌注4℃的1%多聚甲醛磷酸緩沖液300ml，30min內灌注完畢。取腦，后固定于4%甲醛固定液中，6h后，入梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋。連續(xù)切片，片厚5μm，切片分兩組收集。切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2去除內源性過氧化物酶5－10min，95－98℃電爐熱修復，斷電兩次，5%正常羊血清封閉，置37℃溫箱1h之后滴加抗Nestin、BDNF抗體（稀釋比例為1∶100），置濕盒內4℃過夜。第2天37℃溫箱復溫1h，滴加相應的生物素化的二抗，置37℃溫箱2h，滴加辣根過氧化酶標記的鏈霉卵白素，置37℃溫箱1h，DAB－H2O2顯色10－30min。各步驟間均用 0．02mol／L PBS（pH7．2－7．4）洗5min×3次，陰性對照實驗用PBS代替一抗，其余步驟相同，顯色之后常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察。每組選取相同冠狀切面的切片各16張（其中每只選取2張），利用黑馬病理圖像分析系統(tǒng)對200倍視野下海馬CA3區(qū)的Nestin、BDNF免疫反應陽性細胞進行計數(shù)并測量1個單位面積免疫陽性產物的平均灰度值，每組8只大鼠的每個部位共測16個單位面積的灰度值。

7．統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據以均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，使用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析，組間比較用LSD檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．各組大鼠海馬海CA3區(qū)Nestin的表達

各組大鼠海馬CA3區(qū)均有Nestin的表達。Nestin陽性神經元呈棕黃色，Nestin免疫陽性產物著色部位主要為神經元的胞膜與胞漿。模型組CA3區(qū)Nestin陽性神經元數(shù)量較正常對照組增多，免疫陽性細胞平均灰度值降低（P＜0．05）；天麻多糖組、電針組、針藥結合組海馬CA3區(qū)Nestin陽性細胞數(shù)量均較模型組顯著增多，免疫陽性細胞平均灰度值顯著降低（P＜0．05）；針藥結合組CA3區(qū)Nestin陽性細胞數(shù)量較天麻多糖組、電針組均顯著增多，免疫陽性細胞平均灰度值顯著降低（P＜0．05）（圖1，表1）。

圖1 各組大鼠CA3區(qū)Nestin陽性神經元的表達（免疫組化染色，×200），圖中左下方標尺示50μm，右上方標尺示20μm。Fig．1The expression of Nestin IR－positive neurons in hippocampal CA3region in groups of rats（IR，×200），Lower left Scale bar＝50μm，Upper right Scale bar＝20μm．

圖2 多組大鼠海馬CA3區(qū)BDNF陽性神經元的表達（免疫組化染色，×200圖中左下方標尺示50μm右上方標尺示20μm。Fig．2The expression of BDNF IR－positive neurons in hippocampal CA3region in groups of rats（IR，×200），Lower left Scale bar＝50μm，Upper right Scale bar＝20μm．

表1 各組大鼠CA3區(qū)Nestin免疫反應陽性細胞數(shù)量和平均灰度值（ˉx±s，8只鼠／組）Table 1 The numbers and average gray value of Nestin IR－positive neurons in hippocampal CA3region in groups of rats（x±s，8rats／group）

表1 各組大鼠CA3區(qū)Nestin免疫反應陽性細胞數(shù)量和平均灰度值（ˉx±s，8只鼠／組）Table 1 The numbers and average gray value of Nestin IR－positive neurons in hippocampal CA3region in groups of rats（x±s，8rats／group）

注：與正常對照組比較（vs the normal control group），P＜0．05；與模型組比較（vs the model group），P＜0．05；與針藥結合組比較（vs the groups of EA＋PGB），▲P＜0．05。

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2．各組大鼠海馬海馬CA3區(qū)BDNF的表達

各組大鼠海馬CA3區(qū)均有BDNF的表達。BDNF陽性神經元呈棕黃色，BDNF免疫陽性產物著色部位主要為神經元的胞膜與胞漿。與正常對照組比較，模型組CA3區(qū)BDNF陽性神經元數(shù)量增多，免疫陽性細胞平均灰度值降低（P＜0．05）；與模型組比較，天麻多糖組、電針組、針藥結合組CA3區(qū)BDNF陽性神經元數(shù)量均顯著增多，免疫陽性細胞平均灰度值顯著降低（P＜0．05）；與天麻多糖組、電針組比較，針藥結合組CA3區(qū)BDNF陽性神經元數(shù)量顯著增多，免疫陽性細胞平均灰度值顯著降低（P＜0．05）（圖2、表2）。

表2 各組大鼠CA3區(qū)BDNF免疫反應陽性細胞數(shù)量和平均灰度值±s，8只鼠／組）Table 2 The numbers and average gray value of BDNF IR－positive neurons in hippocampal CA3region in groups of rats±s，8rats／group）．

表2 各組大鼠CA3區(qū)BDNF免疫反應陽性細胞數(shù)量和平均灰度值±s，8只鼠／組）Table 2 The numbers and average gray value of BDNF IR－positive neurons in hippocampal CA3region in groups of rats±s，8rats／group）．

注：與正常對照組比較（vs the normal control group），＊P＜0．05；與模型組比較（vs the model group），△P＜0．05；與針藥結合組比較（vs the groups of EA＋PGB），▲P＜0．05。

組別（Group） 陽性細胞數(shù)（The numbers of IR－positive neurons）平均灰度值（The average gray value）正常對照組（Normal）73．25±7．89 135．25±6．13模型組（Model） 83．50±8．33＊ 125．83±8．39＊電針組（EA group） 93．67±6．65＊△▲ 116．70±5．48＊△▲天麻多糖組（PGB group） 95．75±6．32＊△▲ 118．19±5．00＊△▲針藥結合組（EA＋PGB group） 103．50±4．57＊△ 109．04±5．48＊△

討 論

既往的研究表明，成年哺乳動物海馬結構的齒狀回的顆粒下層（SGZ）NSCs一般處于靜止狀態(tài)，各種腦損傷如腦缺血、創(chuàng)傷、癲癇、抑郁等可激活NSCs，分化形成的新神經元最終整合至海馬功能的神經環(huán)路中，參與海馬的各種功能活動，增殖的內源性NSCs存在由增殖區(qū)向靶區(qū)－－海馬、皮質遷移的現(xiàn)象，在 腦 缺 血 損 傷 的 修 復 過 程 中 起 作 用［8，9］。Nestin屬于一種胚胎性第VI類中間絲蛋白，參與細胞骨架的構成，是中樞神經系統(tǒng)發(fā)育過程中NSCs的標志之一，已廣泛應用于NSCs的鑒定［1］。BDNF是神經元自身所支配的靶組織產生的一類含量極微的可溶性多肽分子，在神經元的修復及結構重建過程中起著重要作用；成年機體BDNF維持在較低水平，但在腦缺血等因素影響下內源性BDNF的表達可代償性增加［10］。本實驗結果顯示腦缺血14d時，缺血側海馬CA3區(qū)Nestin和BDNF的表達顯著高于正常組，提示腦缺血14d時海馬CA3區(qū)的NSCs由齒狀回增殖并遷移至此，CA3區(qū)錐體細胞分泌的BDNF有助于促進神經元的損傷修復。但單純自身代償性的內源性BDNF的上調表達不足以完全修復腦損傷［11］。因此，應用針刺、中藥等外界刺激以上調海馬CA3區(qū)BDNF的表達，促進腦缺血后NSCs增殖、分化和遷移，對腦損傷修復及神經功能恢復具有重要意義。

本實驗對腦缺血大鼠應用PGB、低頻（2Hz）電針針刺“百會”“足三里”穴及電針結合PGB治療2w后。結果顯示PGB組、電針組大鼠海馬CA3區(qū)Nestin和BDNF的表達明顯高于模型組；電針結合PGB組較單獨電針組或PGB組CA3區(qū)Nestin和BDNF的表達均顯著增加。電針是在針刺穴位“得氣”后，在針上通以接近人體生物電的微量電流波，以刺激穴位，防治疾病的一種療法，電針可促進局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬Nestin的表達增加［12］，電針可顯著增加慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)、大腦皮質BDNF的表達，對腦缺血損傷具有保護作用［13，14］。PGB是從新鮮天麻中除去天麻素等小分子物質后制備的大分子多糖［6］。有研究表明天麻素可以提高海馬內源性BDNF的表達，具有神經保護作用［15］。本實驗結果表明，PGB結合電針穴位針刺可顯著增加腦缺血大鼠海馬CA3區(qū)Nestin和BDNF的表達，提示針藥結合可通過上調CA3區(qū)Nestin和BDNF的表達，促進內源性NSCs的增殖，以促進成年神經發(fā)生，有助于缺血性腦組織損傷的修復，這可能是電針結合PGB治療腦缺血的重要作用機制之一。

有臨床研究顯示，針刺結合中藥對改善腦梗塞患者的致殘率有很好療效［16］，我室曾研究表明電針與復方丹參片結合可顯著增加慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)BDNF的表達，且作用優(yōu)于單用復方丹參片或電針［14］。本實驗結果進一步提示針藥結合對于腦缺血的療效優(yōu)于單獨針刺或中藥，為臨床上應用電針結合中藥天麻治療腦缺血，促進患者神經功能的恢復提供了一定的形態(tài)學基礎。但對于針藥結合的效果優(yōu)于單獨電針或天麻多糖的原因還有待進一步研究。

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