李 楠 馮振中 趙 艷 谷從友 朱 博 葛 霞

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，安徽，233030；2南京醫(yī)科大學(xué)動脈粥樣硬化研究中心，江蘇，210029）

胃癌是常見且治療困難的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率高居惡性腫瘤前列［1］。許多患者在確診時，腫瘤已屬晚期或已有轉(zhuǎn)移，對失去手術(shù)機(jī)會的患者，常規(guī)細(xì)胞毒性化療藥物效果有限，同時易產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，包括骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、肝損害等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物，主要是環(huán)氧合酶抑制劑和生長抑素（somatostatin，SST）類似物，可以抑制腫瘤生長，副反應(yīng)較低。本研究觀察聯(lián)合使用選擇性COX－2抑制劑NS－398和生長抑素類似物奧曲肽，對胃癌細(xì)胞生長的協(xié)同抑制作用，為腫瘤臨床治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

1．材料

1．1主要試劑

NS－398、奧曲肽及 Caspase－3單克隆抗體均為Sigma公司產(chǎn)品，NS－398粉劑以二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma）溶解，實驗所需終濃度100μmol／L，奧曲肽臨用時用RPMI－1640培養(yǎng)液稀釋到實驗所需終濃度1μmol／L；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司；Annexin V－FITC／碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒為Biouniquer公司產(chǎn)品；COX－2和GAPDH引物合成自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑（Trizol法）購自日本TaKaRa公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1．2細(xì)胞株

人胃癌細(xì)胞株BGC－823，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，由本教研室傳代保存。

1．3主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（Harris HW0301．T－VBA型，美國產(chǎn)），流式細(xì)胞計數(shù)儀（美國Becton Dickinson公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司產(chǎn)品），GDS－8000型凝膠掃描成像系統(tǒng)（美國UVP公司），GeneQuant核酸定量儀（美國Pharmacia Biotech公司），7500Fast Real－Time PCR System（美國 Applied Biosystems公司），超凈工作臺為蘇州凈化設(shè)備廠產(chǎn)品。

2．方法

2．1細(xì)胞培養(yǎng)

將BGC－823細(xì)胞用RPMI－1640培養(yǎng)液加10%FBS，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每日換液一次，2－3d傳代一次。實驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞，于培養(yǎng)瓶內(nèi)生長至80%時，用胰酶消化后制成細(xì)胞懸液備用。

2．2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

青辰處于天葬場的外圍，骷髏鬼陣的余威便已令他膽戰(zhàn)心驚。他蜷縮在大樹的背后，在呼嚎的黑風(fēng)與漫天的沙塵中，努力睜眼朝著陣的中心望。那里，天葬刀朝外散發(fā)著血色的光芒，將師父干枯的身子籠罩在其中。那團(tuán)紅芒是一個巨大的骷髏頭，與天葬刀刀柄處的骷髏彼此呼應(yīng)。他對天葬刀非常熟悉，他有一種感覺，那個紅色的虛影，就是天葬刀的刀魂。就像人有血肉和靈魂，一把刀，也有軀體和刀魂。它用千年來的無數(shù)生命和鮮血滋養(yǎng)，讓自己的刀魂生出了靈性。

將收集的胃癌BGC－823細(xì)胞稀釋為單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104／ml，加入24孔培養(yǎng)板中，每孔2ml，共8孔，待細(xì)胞貼壁后，加入三組藥物，不加藥的2孔為對照組，培養(yǎng)72h。在24h、48h、72h這3個時間點上分別用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，用WinfaStPVR軟件記錄結(jié)果并直接攝片。

2．3細(xì)胞生存曲線

取對數(shù)生長期細(xì)胞1．0×105于50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，分4組，每組復(fù)設(shè)3瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。更換培養(yǎng)基，分別加入三組藥物，不加藥的為對照組，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1－5d各計數(shù)一次加藥組及對照組的細(xì)胞數(shù)，取細(xì)胞計數(shù)平均值，以作用時間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞計數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

2．4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率（Annexin VPI雙染色法）

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1．0×105／ml的細(xì)胞濃度接種于24孔板，每孔2ml，經(jīng)NS－398、奧曲肽和聯(lián)合應(yīng)用組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24h，每組設(shè)2個復(fù)孔，設(shè)不加藥為對照組。細(xì)胞用0．25%胰蛋白酶消化，吹起后收集，在PBS中離心、清洗2次，用預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，AnnexinV－FITC和PI雙染色法，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2．5實時定量（Real－time）PCR測定 COX－2基因表達(dá)

取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)NS－398、奧曲肽和聯(lián)合應(yīng)用組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24h，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，測定cDNA濃度。實時定量PCR反應(yīng)體系測定COX－2mRNA的表達(dá)，結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參計算相對值。

COX－2：Forward－TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATT；

Reverse－AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT ；

GAPDH：Forward－CCATTTGCAGTGGCAAAG；

Reverse－CACCCCATTTGATGTTAGTG。

2．6Western blot檢測 Caspase－3蛋白表達(dá)

用裂解液處理收集細(xì)胞，BCA法測定蛋白濃度，取80μg胞漿蛋白與6×SDS Loading Buffer混合，95℃加熱樣品5min。以蛋白提取液樣品作SDS－PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉后加入一抗，抗體稀釋濃度為1∶1000，于4℃搖動下過夜，次日用TBST清洗，10min×3次。將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育2h，抗體稀釋濃度為1∶3000，TBS－T清洗10min×3次。臨用前將ECL顯色液A與B 1∶1混和，均勻滴加至膜表面，用高敏熒光成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

3．統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，所得數(shù)據(jù)用SPSS14．0統(tǒng)計軟件包 One－Way Anova檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，顯著性檢驗采用單因素方差分析，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．藥物對BGC－823細(xì)胞形態(tài)的影響

藥物作用后，在24h、48h、72h這3個時點上分別用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，對照組細(xì)胞生長旺盛，貼壁生長，呈單層鵝卵石樣緊密排列，為不規(guī)則多邊形，胞質(zhì)均勻透明，核質(zhì)比較大，偽足較長（圖1A）；實驗組：給予NS－398，細(xì)胞生長明顯受抑制，大部分細(xì)胞偽足回縮，排列雜亂，折光率下降（圖1B）；給予奧曲肽，細(xì)胞變小變圓，或松散或聚集成團(tuán)（圖1C）；聯(lián)合用藥大部分細(xì)胞固縮、分解，出現(xiàn)細(xì)胞碎片和懸浮現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)改變明顯強于單獨用藥組（圖1D），且存在時間依賴性（圖2），即兩種藥物單獨使用或聯(lián)合使用48h的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變明顯強于24h（P＜0．05），兩種藥物單獨使用或聯(lián)合使用72h的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變明顯強于48h（P＜0．05）。

A Control 24h（×100）；B 100μmol／L NS－398 24h（×100）；C 1μmol／L Octreotide 24h（×100）；D 100μmol／L NS－398＋1μmol／L Octreotide 24h（×100）圖1 四組藥物作用24h細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化Fig．1Changes in the morphology of BGC－823cells dealed with four－group drugs for 24h

圖2 藥物作用的時間依賴性Fig．2Time depengence of drug action（＊P＜0．05vs．24h，＃P＜0．05vs．48h）

2．藥物對BGC－823細(xì)胞生長的影響

處于對數(shù)生長期的人胃癌細(xì)胞株BGC－823在未給予藥物干預(yù)時細(xì)胞分裂增殖旺盛；單獨給予100μmol／L NS－398，1μmol／L奧曲肽時，細(xì)胞分裂增殖在干預(yù)后第3d開始出現(xiàn)明顯減緩，第5d甚至出現(xiàn)“負(fù)增長”；聯(lián)合100μmol／L NS－398＋1μmol／L奧曲肽時，細(xì)胞分裂增殖在干預(yù)后第2d開始出現(xiàn)明顯減緩，第3d出現(xiàn)“負(fù)增長”。結(jié)果表明藥物不僅抑制細(xì)胞的增殖，而且導(dǎo)致細(xì)胞死亡，聯(lián)合組抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞死亡的作用明顯強于單獨用藥組（圖3，圖4）。

＊P＜0．05Control vs．NS－398and Octreotide圖3 藥物對BGC－823細(xì)胞生長曲線的影響Fig．3Drugs influence the growth curve of BGC－823cells

＊P＜0．05Control vs．NS－398and Octreotide＃P＜0．05Combined vs．NS－398and Octreotide圖4 藥物對BGC－823細(xì)胞生長的影響Fig．4Drugs influence the growth of BGC－823cells

3．藥物誘導(dǎo)BGC－823細(xì)胞凋亡

在流式細(xì)胞儀的散點圖上，1區(qū)為壞死細(xì)胞群，2區(qū)為晚期凋亡細(xì)胞群，3區(qū)為存活細(xì)胞群，4區(qū)為早期凋亡細(xì)胞群（圖5）。FCM檢測顯示隨著作用時間的延長，細(xì)胞凋亡率逐漸增加。作用24h時，單純NS－398組、單純奧曲肽組、聯(lián)合組與對照組相比較，差異具有顯著性（P＜0．01），聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率顯著高于單一用藥組（P＜0．01）；48h時，單純 NS－398組、單純奧曲肽組、聯(lián)合組與對照組相比較，差異具有顯著性（P＜0．01），聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率顯著高于單一用藥組（P＜0．01），與24h組相比較，凋亡率差異具有顯著性（P＜0．01）（表1）。

表1 流式細(xì)胞儀測定藥物誘導(dǎo)BGC－823細(xì)胞的凋亡率Table 1 Effect of drugs on apoptosis of BGC－823cells by flow cytometry（FCM）

圖5 藥物作用48h對BGC－823細(xì)胞凋亡率的影響Fig．5Effect of drugs on apoptosis of BGC－823cells for 48h

4．藥物處理后BGC－823細(xì)胞 COX－2mRNA表達(dá)的變化

空白對照組的BGC－823細(xì)胞COX－2表達(dá)水平較高，分別經(jīng)三組藥物作用24h后，與對照組相比表達(dá)均下調(diào)（P＜0．05），聯(lián)合用藥組COX－2mRNA表達(dá)顯著低于單一用藥組（P＜0．01）（表2）。

表2 BGC－823細(xì)胞COX－2mRNA表達(dá)的比值（%）Table 2 The ratio of COX－2mRNA in BGC－823cells（%）

Values are expressed as mean±SD．＊P＜0．05vs．control，＃P＜0．01vs．NS－398，△P＜0．01vs．Octreotide

5．藥物處理后 BGC－823細(xì)胞 Caspase－3蛋白的表達(dá)

NS－398、奧曲肽及聯(lián)合應(yīng)用組處理BGC－823細(xì)胞24h后，Caspase－3蛋白表達(dá)率分別為26．14%、33%、67．34%，均較對照組升高（P＜0．05），并且聯(lián)合應(yīng)用組表達(dá)量明顯高于單一用藥組 （P＜0．05）（圖6）。

圖6 藥物對BGC－823細(xì)胞Caspase－3蛋白表達(dá)的影響Fig．6Effect of drugs on the expressions of Caspase－3protein

討 論

環(huán)氧合酶－2是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶，在胃癌、大腸癌、食管癌、肝癌等多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，并與腫瘤復(fù)發(fā)、血行轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)［1］，提示以COX－2作為腫瘤治療的分子靶向，使用COX－2抑制劑防治腫瘤，可能成為腫瘤治療的新方向。本實驗結(jié)果表明，選擇性COX－2抑制劑NS－398可以顯著抑制人胃癌BGC－823細(xì)胞的增殖，在一定范圍內(nèi)，具有明確的時間依賴性，而倒置相差顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測均表明NS－398也具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。奧曲肽是人工合成的SST類似物，SST及類似物與其特異性受體結(jié)合后，可降低絲裂原活化蛋白激酶活性，干擾細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2］；也可降低腫瘤的血管內(nèi)皮生長因子水平，減少腫瘤血管形成，抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［3］。本實驗結(jié)果提示奧曲肽能直接誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，這是其抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一。

NS－398和奧曲肽對胃癌BGC－823細(xì)胞的增殖均有抑制作用，但兩種藥物聯(lián)合治療對腫瘤的抑制作用及相關(guān)機(jī)理研究較少。本實驗結(jié)果顯示聯(lián)合用藥對BGC－823細(xì)胞的生長呈協(xié)同抑制作用，其效果明顯高于單一用藥組。由于NS－398和奧曲肽抗腫瘤的機(jī)制不盡相同，具體在哪些共同環(huán)節(jié)上產(chǎn)生協(xié)同作用尚不清楚，可能的機(jī)制包括：①上調(diào)Caspase－3蛋白表達(dá)：Caspase－3是凋亡的執(zhí)行者，在細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)中處于最下游，許多凋亡的信號最終會集結(jié)到此蛋白［4］。Caspase－3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase－3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在本實驗中，NS－398和奧曲肽作用均使BGC－823細(xì)胞中Caspase－3蛋白表達(dá)上調(diào)，聯(lián)合用藥后，Caspase－3蛋白表達(dá)增加更為明顯，提示NS－398和奧曲肽均能直接誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，這是其協(xié)同抗腫瘤的重要機(jī)制之一［5］。②環(huán)氧合酶途徑：惡性腫瘤中COX－2一般呈高表達(dá)，COX－2通過促進(jìn)前列腺素E2（PGE2）的合成，刺激腫瘤新生血管形成，腫瘤新生血管是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，它可以為腫瘤生長提供充足的血供，同時不斷地向宿主輸出腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致惡性腫瘤的生長和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，NS－398和奧曲肽可有效降低BGC－823腫瘤細(xì)胞中 COX－2的含量［6］，抑制胃癌的血管生成，從而抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，而聯(lián)合應(yīng)用時COX－2的表達(dá)降低更明顯，抑制增殖更有效，提示兩者可通過抑制COX－2的表達(dá)產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。有研究報道，奧曲肽能抑制轉(zhuǎn)錄激活蛋白－1（AP－1）的活化，而 COX－2啟動子上有 AP－1結(jié)合位點［7］，當(dāng)兩者聯(lián)合應(yīng)用時，可能加強抑制 AP－1的DNA結(jié)合活性，降低COX－2及其他生長因子的水平甚至停止，從而產(chǎn)生顯著的抑制腫瘤生長、誘導(dǎo)腫瘤死亡的作用［8］。③信號通路途徑：MAPK信號傳導(dǎo)通路在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中有著重要的作用，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤血管生成等。奧曲肽可通過SSTR的介導(dǎo)激活酪氨酸磷酸化酶（PTP），從而調(diào)控 MAPK活性，影響癌基因c－myc、c－jun的轉(zhuǎn)錄，抑制 DNA 的合成，使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入 G0期而停止增殖［9］；Hussin等［10］的研究發(fā)現(xiàn)NSAIDs也能抑制 MAPK通路中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK，兩者聯(lián)合應(yīng)用可能共同抑制了MAPK信號通路的活化，減少腫瘤DNA、蛋白質(zhì)的合成，抑制腫瘤生長。

綜上所述，選擇性COX－2抑制劑能夠抑制腫瘤生長，同時可避免胃腸道黏膜損傷等不良反應(yīng)，奧曲肽也具有抗腫瘤的作用，并與生長抑素受體結(jié)合抑制胃酸分泌，進(jìn)一步減少胃腸道黏膜損傷，所以奧曲肽聯(lián)合NS－398對腫瘤治療有高效、協(xié)同抑制、低副作用等優(yōu)點，具有良好的臨床應(yīng)用價值。本實驗結(jié)果來自于體外培養(yǎng)的胃癌BGC－823細(xì)胞株，對于藥物在體內(nèi)的效果及機(jī)制尚不明確，還需建立動物模型甚至臨床研究予以證實。

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