龐月珊 羅 勇 謝宸宸 李 滿 陳瑞芳 汶海琪

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016）

基質(zhì)衍生因子－1（stroma derived factor－1，SDF－1）與CXC族趨化因子受體4（CXC chemokine receptor4，CXCR4）結(jié)合后能促進(jìn)造血干／祖細(xì)胞遷移、抑制凋亡、促進(jìn)細(xì)胞因子分泌［1］。AC133是干／祖細(xì)胞表面標(biāo)志物，它選擇性表達(dá)于成人骨髓、胎肝、臍帶血和外周血等造血組織的干細(xì)胞和循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞［2］。AMD3100（商品名為Plerixafor）常用來(lái)阻斷SDF－1／CXCR4軸信號(hào)通路，快速動(dòng)員造血干／祖細(xì)胞到外周血［3］，但動(dòng)員到外周血中的干／祖細(xì)胞是否參加了局部的血管新生，尚未見(jiàn)統(tǒng)一報(bào)道。Takemoto等［4］認(rèn)為動(dòng)員到外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞不能參與局部血管再生，而文獻(xiàn)［5］用AMD3100局部治療糖尿病大鼠發(fā)現(xiàn)外周血循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞增多，傷口局部毛細(xì)血管密度顯著增加。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上連續(xù)7d給局灶腦缺血／再灌注大鼠注射AMD3100，檢測(cè)外周血中AC133mRNA表達(dá)和大腦皮質(zhì)CD31陽(yáng)性血管新生情況及局部病理變化，以期闡明AMD3100對(duì)局灶腦缺血／再灌注損傷后缺血半暗帶血管再生的影響。

材料和方法

1．主要試劑

AMD3100（abcam），CD31多克隆抗體（santacruz），DAB顯色劑（北京中杉），總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量擴(kuò)增試劑盒（Takara），SP免疫組化試劑盒及相關(guān)耗材（北京鼎國(guó)）。

2．模型建立和篩選

根據(jù)改良線栓法并參照羅勇等［6］介紹經(jīng)驗(yàn)制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血／再灌注模型。清潔級(jí)雄性SD大鼠65只由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK（渝）2012－0001），隨機(jī)分為假手術(shù)組（S組5只）、模型組（IR 組20只）、AMD3100組（IRA 組20只）、生理鹽水組（IRN組20只）。缺血2h后將IR、IRN和IRA組分為再灌注12h，1、3和7d四個(gè)亞組。AMD3100在大鼠缺血2h開(kāi)始腹腔注射，1．5mg／kg，連續(xù)注射7d。IRN組用同樣的方法注射等體積生理鹽水。根據(jù)Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分：無(wú)神經(jīng)功能缺損，0分；提尾懸吊時(shí)左前肢屈曲，1分；平地行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，2分；平地行走時(shí)身體向左側(cè)倒，3分；意識(shí)喪失不能行走，4分［7］。評(píng)分1－3分選入實(shí)驗(yàn)，0分、4分和 HE染色后無(wú)缺血缺氧病理改變的模型不計(jì)入實(shí)驗(yàn)。

3．熒光定量PCR

取1ml全血，按照Takara說(shuō)明書(shū)提取總RNA，取2μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄成20μl體系cDNA。根據(jù)GenBank提供的序列，Primer－Blast軟件設(shè)計(jì)引物：AC133上游引物5′－CCATGCTCTTACTTCCGGCT－3′，下游引物5′－GTCAGTATCGAGACGGGTCA－3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度102bp；內(nèi)參β－Actin上游引物5′－GCAGGAGTACGATGAGTCCG－3′，下 游 引 物 5－ACGCAGCTCAGTAACAGTCC－3′，產(chǎn) 物 長(zhǎng) 度 74bp。按Takara熒光定量PCR說(shuō)明書(shū)添加試劑，擴(kuò)增條件為預(yù)變性95℃30s，PCR反應(yīng)95℃5s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)。

4．免疫組織化學(xué)染色

將切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育30min，微波修復(fù)21min（高火3min，低火3min，低火與解凍之間15min），自然冷卻至室溫，加動(dòng)物血清封閉液室溫封閉30min，加一抗（CD31一抗稀釋比例為1∶50），同時(shí)滴加PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，4℃過(guò)夜，第2d37℃孵育1h，加二抗37℃孵育30min，加鏈霉素標(biāo)記卵蛋白，室溫孵育30min，DAB顯色，蘇木素染核、脫色、返藍(lán)、常規(guī)脫水、透明、封片。

5．HE染色

常規(guī)HE染色，鏡下觀察核漿染色，封片。

6．血管計(jì)數(shù)

根據(jù) Weidner［8］改良血管計(jì)數(shù)法，先用低倍鏡（×40）找出血管密度最高的三個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域，再用高倍鏡（×200）計(jì)數(shù)被CD31染成陽(yáng)性的血管數(shù)目（血管直徑在6個(gè)紅細(xì)胞直徑以下或者單個(gè)細(xì)胞陽(yáng)性但是和周圍細(xì)胞分界清楚視為是一個(gè)新生血管），每個(gè)樣本結(jié)果用5個(gè)高倍鏡視野下血管數(shù)目均值表示。

7．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，應(yīng)用SPSS 19．0軟件作數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，行單因素方差分析，P＜0．05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．AMD3100對(duì)外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)記物AC133mRNA影響

IRN 12hAC133mRNA表達(dá)開(kāi)始升高，第3d達(dá)到高峰，第7d顯著減少；與IRN組比較，IRA組各時(shí)間點(diǎn)都比較高，IRA 12h外周血AC133mRNA表達(dá)顯著增高，第1d升高到峰值，第3d表達(dá)減少（P＜0．05）（圖1、表1）。

表1 外周血各時(shí)間點(diǎn)AC133mRNA表達(dá)±s，n＝5）Table 1 1The expression of AC133mRNA in peripheral blood at different time（the values of 2－△△CT）±s，n＝5）

表1 外周血各時(shí)間點(diǎn)AC133mRNA表達(dá)±s，n＝5）Table 1 1The expression of AC133mRNA in peripheral blood at different time（the values of 2－△△CT）±s，n＝5）

＊compare with IRN group，P＜0．05

Group Focal cerebral ischemia／reperfusion 12h 1d 3d 7d IRN 0．52±0．05 0．79±0．05 1．12±0．06 0．20±0．01 IRA 0．95±0．07＊ 2．12±0．10＊ 1．26±0．18＊ 0．36±0．03＊

圖1 PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線Fig．1Primary curve and solubility curve

2．局灶腦缺血／再灌注后CD31陽(yáng)性新生血管情況

IRN 1d有血管新生，但以單個(gè)細(xì)胞為主，管徑較??；與S組比較，IRN 3d新生血管密度顯著增加，管徑增大；IRN 7d新生血管密度繼續(xù)增大，不同管徑血管并存；CD31陽(yáng)性新生血管主要分布在缺血半暗帶，梗死區(qū)較少（P＜0．05）（圖2、表2）。

3．AMD3100對(duì)局灶腦缺血／再灌注大鼠大腦皮質(zhì)缺血半暗帶新生血管的影響

與IRN 1d比較，IRA 1d新生血管密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；與IRN 3和7d比較，IRA組CD31陽(yáng)性新生血管密度都顯著減少（P＜0．01）（圖2、表2）。

表2 大腦皮質(zhì)缺血半暗帶各時(shí)間點(diǎn)CD31陽(yáng)性新生血管密度±s，n＝5）（n／mm2）Table 2 The CD31vessels density in rat cerebral cortex ischemic penumbra（ˉx±s，n＝5）（n／mm2）

表2 大腦皮質(zhì)缺血半暗帶各時(shí)間點(diǎn)CD31陽(yáng)性新生血管密度±s，n＝5）（n／mm2）Table 2 The CD31vessels density in rat cerebral cortex ischemic penumbra（ˉx±s，n＝5）（n／mm2）

＃P＜0．01，compare with S group；＊P＜0．01，compare with IRN 3and 7day

Group Focal cerebral ischemia／reperfusion 1d 3d 7d S 3．67±0．57－－IR 8．14±0．83 16．00±2．31＃ 27．50±3．25＃IRN 7．98±1．14 18．00±2．95 30．35±1．56 IRA 6．67±1．57 8．60±2．07＊ 13．25±7．95＊

4．局灶腦缺血／再灌注大鼠大腦皮質(zhì)病理改變情況

與IRN組比較，HE染色I(xiàn)RA組炎癥顯得彌散，IRA 7d壞死最嚴(yán)重，梗死區(qū)充滿泡沫細(xì)胞和壞死神經(jīng)細(xì)胞，而IRN組泡沫細(xì)胞較少（圖3）。

討 論

以前研究認(rèn)為組織損傷后血管再生由已存在的血管內(nèi)皮細(xì)胞激活后增殖遷移形成，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)組織血管形成機(jī)制還有血管生成，即來(lái)源于骨髓的內(nèi)皮祖細(xì)胞通過(guò)增殖分化遷移形成新的有功能的血管［9］。SDF－1是一種由骨髓基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌的對(duì)干／祖細(xì)胞具有強(qiáng)烈趨化作用的蛋白，能使CXCR4陽(yáng)性干／祖細(xì)胞順SDF－1濃度梯度遷移。AMD3100阻斷SDF－1／CXCR4信號(hào)通路后骨髓中干／祖細(xì)胞不能遷移歸巢到骨髓龕位，從而動(dòng)員到外周血［10］。IRA 7d腦組織壞死面積比其他組大，梗死部位壞死神經(jīng)元和泡沫細(xì)胞數(shù)量較多，這可能因?yàn)锳MD3100阻斷了SDF－1／CXCR4軸的修復(fù)過(guò)程，加重了梗死部位的病理改變［11］。

CD31是一種特異性較高且只在內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞表達(dá)的抗原常用來(lái)標(biāo)記血管。AC133mRNA在IRA 12h顯著升高，第1d達(dá)峰值，第3d下降，這提示連續(xù)注射AMD3100后可能引起外周血中表達(dá)AC133的內(nèi)皮祖細(xì)胞快速增加，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道AMD3100能快速動(dòng)員骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)入外周血相符［3，10］，但大腦皮質(zhì)缺血半暗帶血管密度卻沒(méi)有隨著外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞增加而增加，IRA 3和7d新生血管密度比IRN組顯著減少。文獻(xiàn)［12］中指出雖然AMD3100大量動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞到外周血，但其遷移、黏附、克隆能力顯著減弱，推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)員到外周血的內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)大腦缺血皮質(zhì)血管生成作用較小。AMD3100對(duì)第1d血管密度影響較小，可能因?yàn)榫衷钅X缺血／再灌注24h血腦屏障的超微結(jié)構(gòu)開(kāi)始破壞［13］后更有利于骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞通過(guò)，所以在這階段AMD3100對(duì)由骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞參與的血管生成影響不大。AMD3100阻斷骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢的主要信號(hào)通路后，IRA 3和7d血管密度顯著減少，我們推測(cè)骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞可能參與局灶腦缺血／再灌注損傷后缺血半暗帶血管再生，并發(fā)揮著重要作用。

本團(tuán)隊(duì)前期研究使用 AMD3100 1．5mg／kg，連續(xù)注射4d，第7d發(fā)現(xiàn)大腦皮質(zhì)缺血半暗帶新生血管數(shù)量比IRN組增多［14］，而本研究采用同樣方法持續(xù)注射7d，第7d時(shí)新生血管數(shù)量顯著減少。這可能因?yàn)锳MD3100與CXCR4結(jié)合是可逆的，AMD3100失去競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)后，CXCR4能重新與SDF－1結(jié)合恢復(fù)促進(jìn)干／祖細(xì)胞遷移、黏附、歸巢的能力［15］。因此尋找一種合理的方案，使AMD3100動(dòng)員到外周血的干／祖細(xì)胞發(fā)揮其正常生理功能成為未來(lái)的研究方向。

圖 版 說(shuō) 明

圖2 大腦皮質(zhì)缺血半暗帶各時(shí)間點(diǎn)CD31陽(yáng)性新生血管情況

圖3 局灶腦缺血／再灌注7d大腦皮質(zhì)病理改變

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．2The changes of CD31vessels at different time points after focal cerebralischemia／reperfusion in rat cerebral cortex ischemic penumbra（n＝5，×200）

Fig．3The Pathologic changes in rat cerebral cortex after focal cerebral ischemia／reperfusion 7day（n＝5，×400）

↗CD31vessel；▲Infarction district；★ischemic penumbra

↗necrosis of neurons；▲foam cell

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