蔡永萍 萬 陽 劉德寶 周長順 尹 旭 黃 格 孟 剛

（1安徽醫(yī)科大學病理學教研室，2安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院骨科，3安徽醫(yī)科大學七年制臨床專業(yè)2012級2班，合肥230032）

骨肉瘤是臨床常見的發(fā)生于骨的原發(fā)性惡性骨腫瘤，主要發(fā)生于青少年，惡性程度高，是導致青少年死亡的第二大惡性腫瘤［1］。目前，傳統(tǒng)的治療方法主要是采用包括新輔助化療在內(nèi)的綜合治療，如手術前化療、手術和術后定期化療，但多數(shù)病人最終死于遠處肺轉移［2］。越來越多的研究證實，腫瘤干細胞的存在是導致傳統(tǒng)治療方法失敗的主要原因［3］。

Sox（SRY－like HMG box）基因家族是一類具有 HMG（high mobility group）特征結構域的轉錄因子［4］，通過與靶基因的HMG結構域特異結合后調(diào)節(jié)下游靶基因的表達，在維持干細胞的多能性及決定細胞分化方面具有重要作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，Sox2維持成骨細胞前體細胞的多向分化潛能和“干細胞樣”特征的重要調(diào)控因子［5，6］，在保持其分裂的潛能并抑制其向成骨細胞分化的過程中起關鍵作用。隨后研究表明，Sox2也是維持骨肉瘤中腫瘤干細胞特性的關鍵因子［7，8］。但目前關于Sox2在臨床骨肉瘤標本中的表達及其臨床意義方面的研究甚少。本研究通過免疫組織化學方法檢測Sox2在骨肉瘤標本中的表達，并探討該表達與臨床病理因素的關系。

材料和方法

1．材料

收集安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科2004年1月－2010年12月間存檔的58例石蠟骨肉瘤標本，所有病例經(jīng)過復查為原發(fā)性骨肉瘤。其中男性33例，女性25例；年齡9－44歲，中位年齡17歲。組織學分型包括51例骨肉瘤（骨母細胞亞型21例，軟骨母細胞亞型18例，成纖維細胞型12例）和7例高分化中心型骨肉瘤。臨床分期按Enneking臨床分期法（1986年修訂）。12例骨化性肌炎石蠟標本（男7例，女5例）作為正常對照。所有標本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，分別作HE及免疫組化染色。

2．試劑及免疫組化方法

兔抗人Sox2單克隆抗體和免疫組化Maxvision試劑盒均購自中杉金橋公司。免疫組化染色方法按Maxvision試劑盒說明書操作，檸檬酸鹽（pH 6．0）微波爐10min煮沸法進行抗原修復。用PBS代替一抗作陰性對照，陽性對照為已知Sox2陽性表達的肺鱗狀細胞癌。由于部分骨肉瘤蠟塊中存在骨組織，在抗原修復時容易掉片，我們運用防脫片的玻璃切片二次涂多聚賴氨酸，這種方法明顯減少脫片的現(xiàn)象。

3．結果判斷

Sox2為細胞轉錄因子，免疫組化陽性染色主要位于細胞核，為粗細不一的黃－棕黃色顆粒。陽性評分采用半定量方法：（1）按細胞染色強弱評分：0分不著色，1分棕黃色，2分棕褐色；（2）選取10個高倍視野 （×400），計數(shù)陽性腫瘤染色細胞占腫瘤細胞總數(shù)的百分比：0分≤5%，1分5%－33%，2分34%－67%，3分68%－100%；（3）加和判斷結果：≤1為陰性，＞1為陽性。

4．統(tǒng)計學處理

各項參數(shù)經(jīng)量化處理后輸入計算機，應用SPSS13．0統(tǒng)計分析軟件，采用卡方檢驗率的差異性。α＝0．05為檢驗水準，結果均以P＜0．05為有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．Sox2在骨肉瘤和骨化性肌炎中的表達

Sox2為細胞轉錄因子，細胞核陽性染色才能判定為真正的陽性。Sox2在骨肉瘤標本中的陽性表達率為20．69% （12／58），而在骨化性肌炎中表達率為0% （0／12），Sox2在骨肉瘤標本中的陽性率顯著高于對照組骨化性肌炎（P＜0．01）（表1）。骨肉瘤組織學診斷依據(jù)為高度異型性的腫瘤細胞和腫瘤細胞直接產(chǎn)生的骨樣基質（圖1A），Sox2在骨肉瘤細胞中表達為強陽性（圖1a）。骨化性肌炎里有大量新生的骨基質，骨母細胞圍繞在骨基質周圍（圖1B），在所有的12例骨化性肌炎中骨母細胞Sox2均為陰性表達（圖1b），僅在1例骨化性肌炎局灶骨母細胞有弱陽性表達。

表1 Sox2在骨肉瘤和骨化性肌炎中的表達Table 1 Expression of Sox2in osteosarcoma and myositis ossificans

圖1 （A，HE×200）普通型骨肉瘤細胞具有高度異性，局部可見骨樣基質；（a，Maxvision×200）骨肉瘤細胞Sox2細胞核陽性表達；（B，HE×200）骨化性肌炎，成骨細胞圍繞在新生骨樣基質周圍；（b，Maxvision×200）骨化性肌炎中成骨細胞Sox2陰性表達Fig．1（A，HE×200）Atypical neoplasm cells in conventional osteosarcoma with focal osteoid．（a，Maxvision×200）Nuclear positive staining of Sox2in osteosarcoma cells．（B，HE×200）Myositis ossificans with newly formed bone surrounded by osteoblasts．（b，Maxvision×200）Negative nuclear staining of Sox2in osteoblasts in myositis ossifican．

2．Sox2在骨肉瘤中的表達與臨床病理因素之間的關系

臨床分期采用Enneking臨床分期法，此系統(tǒng)分期依據(jù)腫瘤的病理組織學分級，結合X線影像學腫瘤局部范圍，如骨皮質和軟組織，以及有無肺轉移。Ⅰ期為低度惡性，Ⅱ期為高度惡性，無局部或遠處轉移，Ⅲ期為高度惡性，并且有局部或遠處轉移。Ⅱ期和Ⅲ期為高度惡性，預后明顯差于Ⅰ期，因此我們比較Ⅰ期與Ⅱ＋Ⅲ期兩組差別。Enneking臨床分期中Ⅰ期骨肉瘤Sox2陽性表達率為10．00%（1／10），Ⅱ＋Ⅲ期Sox2陽性表達率為22．92% （11／48），兩組比較差異有顯著性（P＜0．05）（表2）。而Sox2表達與臨床病理因素如患者年齡、性別、部位，組織學亞型均無關（P＞0．05）（表2）。

表2 Sox2在骨肉瘤中表達情況與主要臨床病理參數(shù)之間關系Table 2 Comparison of key clinical and pathologic variables among Sox2－postive and Sox2negative subgroup

討 論

近年來，腫瘤干細胞學說受到越來越多人的關注，腫瘤干細胞具有4大特征：自我不斷更新、多向分化潛能、高增值能力和耐藥性［9］。目前認為化療、放療等傳統(tǒng)治療方法無法徹底消除腫瘤干細胞，是導致腫瘤治療失敗的根本原因。腫瘤干細胞在乳腺癌、膠質瘤、結直腸癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤中均已成功分離［10］。

關于骨肉瘤腫瘤干細胞的研究，最早由Gibbs和同事報道［11］發(fā)現(xiàn) CD133、Stro1－1和Sca－1可作為骨肉瘤腫瘤干細胞標志，富集腫瘤干細胞的骨肉瘤細胞群具有高增殖能力和體外培養(yǎng)形成懸浮球的能力，同時接種裸鼠體內(nèi)易形成腫瘤。近年來Basu－Roy U研究組發(fā)現(xiàn)［5］Sox2是維持骨原細胞自我不斷更新并抑制其向成骨細胞分化的重要調(diào)控因子。但他們在隨后研究中發(fā)現(xiàn)［7］，骨肉瘤細胞懸浮球中Sox2表達增高，并且敲出Sox2的骨肉瘤細胞失去形成懸浮球的能力，這表明Sox2可能也是參與維持骨肉瘤腫瘤干細胞特性的關鍵因子之一。但到目前為止，國內(nèi)外有關Sox2與骨肉瘤臨床病理特征及預后關系的報道不多。

Sox2是Sox家族20個成員中的一個，定位于染色體3q26．3－q27，最初研究發(fā)現(xiàn)Sox家族是胚胎發(fā)育和干細胞發(fā)育的重要調(diào)控因子［4］。隨后的研究證實Sox2參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲。Bass［12］和 Rudin［13］研究表明，在23%肺鱗狀細胞癌，15%食管癌和27%肺小細胞癌中發(fā)現(xiàn)Sox2基因擴增，并且在體外實驗細胞水平抑制Sox2表達能夠抑制細胞增殖，提示Sox2可能通過促進細胞增殖，抑制細胞分化促進腫瘤的發(fā)生。另外，在膠質瘤［14］，黑色素瘤［15］中也均有研究報道Sox2過表達并促進腫瘤的侵襲。

本研究結果發(fā)現(xiàn)Sox2在骨肉瘤中的陽性表達率為20．69% （12／58），而在骨化性肌炎中表達率為0%（0／12），Sox2在骨肉瘤標本中的陽性率顯著高于對照組骨化性肌炎（P＜0．01）。并且Sox2的表達與臨床分期晚有關（P＜0．05），提示Sox2陽性表達的骨肉瘤病人臨床預后更差，而Sox2陽性表達的骨肉瘤病人臨床預后差可能與這部分病人腫瘤干細胞數(shù)目較多有關。腫瘤干細胞具有耐藥性，腫瘤組織中Sox2陽性細胞越多，含有的腫瘤干細胞就越多，術后一些殘留腫瘤干細胞通過自我更新和多向分化，導致腫瘤復發(fā)和轉移［16］。

大量研究已證實經(jīng)典Wnt信號途徑在骨的發(fā)育中扮演重要角色，活化的Wnt通路促進間充質干細胞向成骨細胞方向分化［17］。我們前期的研究結果發(fā)現(xiàn)［18］，在骨肉瘤中經(jīng)典 Wnt信號通路是失活的，同時在骨肉瘤細胞中激活Wnt信號通路能夠抑制細胞增殖并促進其向成骨細胞分化。本研究發(fā)現(xiàn)與我們前期研究結果一致，Sox2參與維持骨肉瘤腫瘤干細胞自我不斷更新狀態(tài)并抑制分化，可能是通過抑制經(jīng)典 Wnt信號通路［7］。

總之，Sox2可能在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移中發(fā)揮重要作用，而骨肉瘤中Sox2的表達與臨床預后差相關，提示Sox2的表達可考慮作為骨肉瘤臨床評價生物學行為及判斷預后的指標之一。

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