徐 麗 宮 喜 劉 卉 宋 軍 周瑞祥＊

（1福建醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系 神經(jīng)生物學(xué)研究中心 福州350004；2莆田學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 莆田351100）

胃癌是人類最常見惡性腫瘤之一［1］，我國是胃癌高發(fā)區(qū)之一，近年來不少地區(qū)胃癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，探討其發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及尋找有效的治療手段是目前研究的重點(diǎn)。褪黑素化學(xué)名稱為N－乙?；?－甲氧基色胺，主要由機(jī)體的松果腺合成分泌。研究發(fā)現(xiàn)［1］褪黑素對(duì)腫瘤患者和動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)性腫瘤生長均有抑制作用。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)褪黑素在體內(nèi)體外均明顯抑制小鼠MFC前胃癌細(xì)胞增殖［4，5］，但具體作用機(jī)制仍未明了。

ERK1／2是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)增殖的關(guān)鍵信號(hào)通路之一，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移［6］，磷脂酰肌醇－3激酶（phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K）－Akt信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)影響細(xì)胞生長、增殖、凋亡［7］，NF－κB是一種真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，是胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［8］。本部分運(yùn)用 CCK－8、Western blot等技術(shù)手段探討褪黑素在抑制小鼠MFC前胃癌細(xì)胞增殖過程中對(duì)ERK、Akt及NF－κB表達(dá)的影響。

材料和方法

1．小鼠MFC前胃癌細(xì)胞株的培養(yǎng)

小鼠MFC前胃癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，將處于對(duì)數(shù)生長期的MFC細(xì)胞傳代后制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×105濃度接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后用2mmol／L褪黑素（Sigma公司，MW 232．2）干預(yù)，培養(yǎng)0min，30min，1h，6h，24h，48h，72h。

2．免疫印跡法檢測(cè)褪黑素對(duì) MFC細(xì)胞p－ERK／ERK、p－Akt／Akt及 NF－κB蛋白表達(dá)的影響

從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，加入0．5ml細(xì)胞裂解液（每100μl RIPA中加入1μl PMSF），提取的總蛋白樣品經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度，配置12%SDSPAGE分離膠及5%濃縮膠，取30μg蛋白質(zhì)上樣，110V恒壓電泳1．5h，110V恒壓，冰上轉(zhuǎn)膜2h。室溫中封閉1h后分別與待測(cè)蛋白的第一抗體反應(yīng)，所用的第一抗體稀釋度分別為：兔抗p－ERK、兔抗ERK、兔抗p－Akt、兔抗 Akt及 NF－κB多克隆抗體（均為Cell Signaling公司）均為1∶1000，兔抗Actin抗體（Santa Cruz公司）為1∶2000?？贵w與膜上的抗原4℃反應(yīng)過夜后，運(yùn)用BeyoECL Plus工作液顯色，凝膠成像分析。

3．PI3K抑制劑 Wortmannin對(duì)MFC細(xì)胞增殖活性的影響

細(xì)胞以5000個(gè)／孔的密度接種于96孔板，取phosphatidylinositol 3－kinase（PI3K）抑制劑 Wortmannin（碧云天生物公司），用DMSO（上海生工生物工程公司）配制濃度為20mg／ml，隨后用培養(yǎng)基稀釋至1μmol／L，細(xì)胞貼壁后給予1μmol／L Wortmannin和／或2mmol／L褪黑素。用藥8h后，加入含10μl CCK－8（日本同仁化學(xué)研究所）溶液的培養(yǎng)液100μl，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1h；450nm測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)分為四組：空白對(duì)照、MLT組、Wortmannin組、Wortmannin＋MLT組，每組設(shè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)行單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，以P＜0．05為有顯著性差異。

結(jié) 果

1．褪黑素對(duì)MFC細(xì)胞p－ERK／ERK表達(dá)的影響

ERK1／2是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵信號(hào)通路之一，我們應(yīng)用Western blot技術(shù)分析該途徑是否參與介導(dǎo)褪黑素抑制MFC細(xì)胞增殖過程。結(jié)果如圖1顯示：給予2mmol／L褪黑素干預(yù)30min時(shí)，p－ERK表達(dá)下降，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)干預(yù)時(shí)間達(dá)24h時(shí)，p－ERK表達(dá)明顯下降，48h仍處于較低水平，每組ERK表達(dá)均未見明顯改變，因此p－ERK／ERK比值在24h、48h下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

圖1 褪黑素對(duì)MFC細(xì)胞p－ERK／ERK表達(dá)的影響（“＊”示與空白對(duì)照組比較，P＜0．05）Fig．1Effect of melatonin on p－ERK／ERK expression in MFC cells（＊P＜0．05vs blank control）

2．褪黑素對(duì)MFC細(xì)胞p－Akt／Akt表達(dá)的影響

PI3K－Akt信號(hào)通路廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡等調(diào)控，為證實(shí)該途徑是否參與介導(dǎo)褪黑素抑制MFC細(xì)胞增殖過程，我們應(yīng)用Western blot技術(shù)分析相關(guān)蛋白活性變化。結(jié)果如圖2顯示：給予2mmol／L褪黑素干預(yù)24h時(shí)，p－Akt表達(dá)明顯下降，48h仍處于較低水平，Akt表達(dá)均未見明顯改變，因此p－Akt／Akt比值在24h、48h下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

圖2 褪黑素對(duì) MFC細(xì)胞p－Akt／Akt表達(dá)的影響（“＊”示與空白對(duì)照組比較，P＜0．05）Fig．2Effect of melatonin on p－Akt／Akt expression in MFC cells（＊P＜0．05vs blank control）

3．PI3K抑制劑Wortmannin對(duì)MFC細(xì)胞增殖活性的影響

為進(jìn)一步了解PI3K－Akt信號(hào)途徑在褪黑素抑制MFC細(xì)胞增殖信號(hào)通路中的意義，我們檢測(cè)PI3K抑制劑Wortmannin對(duì)MFC細(xì)胞增殖的影響。Wortmannin可以通透細(xì)胞，和PI3K的110kD催化亞基相結(jié)合，特異性抑制PI3K，從而抑制PI3K－Akt信號(hào)途徑，包括抑制Akt磷酸化等。結(jié)果顯示，Wortmannin或MLT干預(yù)8h后，均可明顯抑制MFC細(xì)胞增殖活性，而且 Wortmannin與MLT作用有明顯協(xié)同效應(yīng)。

圖3 PI3K抑制劑Wortmannin與褪黑素對(duì)MFC細(xì)胞增殖活性的影響（“＊”示與空白對(duì)照組比較，P＜0．05，“＊＊”示P＜0．01）Fig．3Effect of Wortmannin，a antagonist of PI3K，and MLT on MFC cell proliferation activity（＊P＜0．05vs blank control，＊＊P＜0．01vs blank control）

4．褪黑素對(duì)MFC細(xì)胞NF－κB表達(dá)的影響

NF－κB是胃癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，為了解其在褪黑素抑制MFC細(xì)胞增殖中的意義，我們檢測(cè)了NF－κB的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，2mmol／L褪黑素干預(yù)30min，1h，6h，24h，48h，72h，NF－κB的表達(dá)均未見明顯改變（P＞0．05）。

圖4 褪黑素對(duì) MFC細(xì)胞NF－κB表達(dá)的影響（“＊”示與空白對(duì)照組比較，P＜0．05）Fig．4Effect of melatonin on NF－κB expression in MFC cells（＊P＜0．05vs blank control）

討 論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多基因突變的累積過程。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，蛋白激酶家族－絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPKs）是最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，對(duì)細(xì)胞的癌變及腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到重要的調(diào)控作用。MAPKs是一個(gè)蛋白激酶家族，目前已發(fā)現(xiàn)MAPKs家族中最重要的是ERK1／2，ERK1／2是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)增殖的關(guān)鍵信號(hào)通路之一，可直接影響細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞內(nèi)，只有磷酸化的ERKl／2才具有活性，而激活的ERKl／2可通過多條途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程［9］，例如：活化的ERK由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，可通過磷酸化Elk－1三重復(fù)合物而誘導(dǎo)c－fos基因，最終激活激動(dòng)蛋白－1（AP－1），AP－1可增加細(xì)胞周期素 Dl（Cyclin D1），促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖［10］；磷酸化的ERK能夠活化 NF－κB，進(jìn)一步誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl－2、Bcl－XL的表達(dá)，并促進(jìn)Bcl－2的磷酸化，降低促凋亡蛋白Bad磷酸化，促進(jìn)Bad、Bim降解，發(fā)揮抗凋亡作用［11］；激活的ERK可通過增強(qiáng) AP－1活性，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，MMPs可降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和侵襲［12］。因?yàn)镋RK1／ERK2參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移，因此，ERK1／ERK2通路抑制劑目前在臨床上已被用作一種新型抗癌藥物。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)褪黑素作用24h、48h時(shí)，MFC細(xì)胞ERK1／2的磷酸化水平明顯低于對(duì)照組，而ERK1／2總量不變。說明褪黑素不是通過抑制MFC細(xì)胞ERK1／2表達(dá)而是通過抑制ERK1／2的激活，從而抑制胃癌細(xì)胞MFC增殖。

另一條與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)通路是磷脂酰肌醇－3激酶（phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K）－Akt，PI3K－Akt信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)影響細(xì)胞生長、增殖、凋亡。PI3K可調(diào)節(jié)Akt的磷酸化過程，Akt是P13K通路中的關(guān)鍵分子，產(chǎn)生P13K途徑的主要生物學(xué)效應(yīng)，主要包括控制細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡［13］。相關(guān)機(jī)制包括：增加抗凋亡基因Bcl－2的表達(dá)；直接或間接磷酸化Bcl－2家族中的促凋亡蛋白Bad上Ser136位殘基，從而終止Bad在線粒體膜上對(duì)Bcl－2或Bcl－XL的拮抗作用，使被釋放后的 Bcl－2或Bcl－XL能恢復(fù)其抗凋亡功能［14］；活化的Akt也可磷酸化細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物p21Cip1和p27Kip1，p21Cip1被磷酸化后從細(xì)胞核中退出，并解除對(duì)CDK的抑制，從而引起細(xì)胞周期變短，加速細(xì)胞周期進(jìn)程；Akt還可抑制Caspase活化等。臨床上多種腫瘤，如胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌等都可見到PI3K－Akt通路的過度激活［15］，而抑制PI3K或Akt的活性，就可起到有效的抗腫瘤治療作用。本研究中褪黑素在作用24h、48h后明顯抑制p－Akt的產(chǎn)生，說明抑制Akt激活也是褪黑素抑制MFC細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。應(yīng)用PI3K抑制劑Wortmannin干預(yù)8h后，可明顯抑制 MFC細(xì)胞增殖活性，而且 Wortmannin與MLT在抑制MFC增殖作用上有明顯協(xié)同效應(yīng)，這就進(jìn)一步說明褪黑素通過抑制p－Akt產(chǎn)生，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

NF－κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，由 RelA、RelB、RelC、NF－ΚB1和 NF－κB2組成。在腫瘤細(xì)胞中，NF－κB即有可能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生長［16］，也有可能作為促凋亡因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17］。在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中，NF－κB可通過調(diào)節(jié)Bcl－2家族、IL－8、COX－2等［18］，最終促進(jìn)胃癌 的發(fā)生 發(fā)展。為進(jìn)一步探討褪黑素抑制胃癌細(xì)胞增殖機(jī)制，我們檢測(cè)褪黑素對(duì)MFC細(xì)胞NF－κB表達(dá)的影響，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)褪黑素對(duì)NF－κB有影響。

綜上所述，褪黑素是通過抑制ERK1／2、Akt磷酸化，而不是通過抑制 ERK1／2、Akt及 NF－κB表達(dá)，從而發(fā)揮其體外抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用。

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