石 麗 王穎超 羅朋力

高海拔缺氧可以造成循環(huán)血中氧分壓或氧含量下降致使組織細胞供氧不足，產(chǎn)生一系列病理狀態(tài)。缺氧發(fā)生后，腎臟是容易受損的器官，高原急性缺氧所致腎損傷進一步引起急性腎功能障礙，甚至多器官功能障礙及衰竭［1～3］。既往研究表明，氧化應激是高原急性缺氧時腎臟損傷的重要機制之一，而NADPH氧化酶的激活則是機體產(chǎn)生氧化應激的重要原因［4～6］。筆者通過復制大鼠腎臟高原急性缺氧損傷模型，通過檢測腎組織氧化應激相關指標的變化及急性缺氧后不同時程點大鼠腎臟NOX4 和P47phox 蛋白水平的表達變化，為有效預防腎臟缺氧損傷提供相關實驗依據(jù)。

材料與方法

1.實驗動物及試劑:7 周齡健康清潔級SD 大鼠60 只，均為雄性，體重180 ～200g，由蘭州大學動物實驗中心提供(實驗動物合格證號:0002511)，經(jīng)適應性喂養(yǎng)兩周后用于實驗。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;);NOX4 和P47phox 一抗(北京博奧森生物技術有限公司生產(chǎn)，1∶2000);β-actin 單克隆抗體(美國Sigma 公司，1∶2000);二抗(DAK 公司，1∶2000)

2.實驗方法:(1)復制急性缺氧動物模型:使用青海大學醫(yī)學院高原醫(yī)學研究中心低壓氧艙模擬海拔5000 米高原低氧環(huán)境復制動物模型，將大鼠按照進入低壓氧艙的時間分為0.5、1、3、5、7 天，同時設置對照組(西寧地區(qū))等6 個組。(2)血液血肌酐、尿素氮測定:大鼠腹主動脈采血，3000r/min、15min 離心，離心后吸取上清液，取血清保存于-80℃冰箱里備用。用生化儀來測定血尿素氮(Bun)和血肌酐(Scr)水平。(3)氧化指標SOD、MDA 測定:嚴格按試劑盒說明書，測定腎臟組織中SOD、MDA 含量。(4)腎臟NOX4、P47phox 蛋白含量:Western blot 法檢測腎臟組織NOX4、P47PHOX 蛋白的表達。取腎臟組織200mg，提取組織蛋白以BCA 蛋白分析法測蛋白濃度。電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，封閉1h，加入一抗和β-actin 單克隆抗體，4℃過夜，二抗室溫孵育1h，洗滌，ECL顯示條帶。

結 果

1.大鼠血肌酐、尿素氮改變:隨著缺氧時間的延長，大鼠肌酐及尿素氮水平呈先升高后下降的趨勢(圖1)。

圖1 大鼠不同缺氧時間血清肌酐、尿素氮濃度變化

2.氧化相關指標變化:腎臟SOD 水平一直下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，MDA 表達水平總體呈升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，圖2)。

3.蛋白表達變化:大鼠腎臟NOX4 及P47phox 蛋白表達均隨著缺氧時間延長而開始升高，于5 天后開始降低，7 天恢復大致正常水平(圖3)。

討 論

圖2 大鼠不同缺氧時間腎臟SOD、MDA 的表達變化

圖3 大鼠不同時程腎臟蛋白表達變化

機體處于高海拔環(huán)境會引發(fā)一系列連鎖反應，在生理、心理和行為等各層次都會發(fā)生一定變化［5～10］。本研究利用低壓氧艙模仿高原5000 米缺氧環(huán)境，實驗條件可以模仿高原缺氧環(huán)境，通過比較不同時間內(nèi)氧分壓和動脈血氧飽和度下降程度，來觀察全身各個器官的功能、甚至結構的變化，其中腎臟對缺氧很敏感。既往研究表明，氧化應激在缺氧所致腎損傷中起著重要作用［5～7］。所謂氧化應激是由于人體新陳代謝過程中產(chǎn)生的“自由基”產(chǎn)生過多，超過了正常組織的抗氧化防御系統(tǒng)。高原缺氧狀態(tài)可導致氧化應激增加和機體的抗氧化功能下降，是引發(fā)急性腎衰竭等多種疾病的重要原因。

本研究通過對血清肌酐、尿素氮濃度的測定，發(fā)現(xiàn)肌酐、尿素氮自缺氧12h 就開始升高，5 天后開始下降。說明高原缺氧狀態(tài)確實對大鼠腎臟造成一定程度的損傷，之后其濃度的下降，可能是機體對高原缺氧環(huán)境的逐漸習服過程。通過觀察腎臟高原急性缺氧時SOD、MDA 水平變化，表明高原缺氧對腎臟造成的損傷機制，可能是由于腎細胞及器官水平缺氧造成SOD 活力下降、MDA 水平升高，腎組織清除氧自由基的能力下降，從而使機體產(chǎn)生極多氧自由基和各種蛋白水解酶、炎性物質(zhì)，進一步發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應。相關研究表明，過多ROS 產(chǎn)生使機體抗氧化能力下降，氧化/還原動態(tài)失衡，造成機體蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等的氧化損傷，使機體處于一種嚴重的應激狀態(tài)［4～7］。ROS 是由氧激發(fā)的化學性質(zhì)十分活潑的分子，近年來研究顯示，NADPH 氧化酶的過度活化可能是細胞內(nèi)ROS 高表達的重要原因，它在炎癥和腎損傷等疾病中發(fā)揮重要作用，P47phox 和NOX4 等亞基則是激活NADPH 氧化酶的關鍵亞基，可能會進一步介導ROS 產(chǎn)生，使機體產(chǎn)生氧化應激［3～6］。本實驗通過測定P47phox 和NOX4 兩個亞基蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)其表達量隨著缺氧時間的延長逐漸升高，可能隨著機體對氧化應激的適應，缺氧后期表達量有所下降。可以推測高原缺氧可能誘導了NADPH 氧化酶的表達，造成腎臟病理損傷。因此通過抑制NADPH氧化酶的活性可有效的降低ROS 的產(chǎn)生，從而減輕高原急性缺氧所引起的腎臟病變。

總之，本結果模擬在低壓氧艙急性缺氧的病理過程中，NADPH 氧化酶可能起到重要作用，因此對NADPH 氧化酶的抑制尤為重要。缺氧腎臟損傷的發(fā)生涉及很多復雜因素，本研究從一個側面推測了高原缺氧所致腎損傷的發(fā)病機制，為進一步探討高原環(huán)境下防治腎損傷提供了實驗依據(jù)。

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