劉洪義，梁五生，劉忠梅，張洪祥，楊立群

（1.黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，國家馬鈴薯病毒檢測重點實驗室，哈爾濱 150001；

2.浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院生物技術(shù)研究所水稻生物學國家重點實驗室，杭州 310058）

黑龍江省部分地區(qū)馬鈴薯Y病毒株系檢測

劉洪義1，梁五生2，劉忠梅1，張洪祥1，楊立群1

（1.黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，國家馬鈴薯病毒檢測重點實驗室，哈爾濱 150001；

2.浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院生物技術(shù)研究所水稻生物學國家重點實驗室，杭州 310058）

從黑龍江省克山、訥河、五大連池和北安大田種植的馬鈴薯上采集馬鈴薯病葉，提取總RNA，利用之前驗證過的引物，進行反轉(zhuǎn)錄、PCR擴增，以及焦磷酸測序，以鑒定感染的馬鈴薯Y病毒（PVY）株系。結(jié)果表明，克山有2個樣品分別感染PVYN:O和PVYN-Wi；訥河有2個樣品感染PVYN-Wi；五大連池有2個樣品分別感染PVYN:O和PVYN-Wi；北安有1個樣品感染PVYN-Wi。結(jié)合之前報道的9份黑龍江省馬鈴薯病樣的PVY株系鑒定結(jié)果，表明黑龍江省大田種植的馬鈴薯至少存在PVYN-Wi、PVYN:O、PVYNTN和PVYN4種PVY株系侵染；而且，由于PVYN-Wi侵染了16份已鑒定病樣中的7份，而其余3種株系均僅侵染3份病樣，顯示PVYN-Wi可能為優(yōu)勢株系。

黑龍江?。获R鈴薯；馬鈴薯Y病毒；病毒株系鑒定；焦磷酸測序

馬鈴薯是中國第四大糧食作物，糧菜飼兼用，加工用途多，產(chǎn)業(yè)鏈條長。發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)業(yè)對于確保我國糧食安全、促進農(nóng)民增收、振興農(nóng)村經(jīng)濟具有重要意義[1-2]。黑龍江省日照充足，晝夜溫差大，土壤多為黑土，適合馬鈴薯生長。黑龍江省屬于我國種植馬鈴薯的優(yōu)勢省份之一[3]。在馬鈴薯生長過程中，常受到各種病原侵害[4-7]，其中，馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）對馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大[8-11]。PVY是一種RNA病毒，是具有重大病害影響的十大植物病毒之一[12]。根據(jù)其病理效應(yīng)，PVY可分為O、N、C、Z、E等多個不同類群，其中類群N又可分為PVYN、PVYNTN、PVYN-Wi等多個株系[9,13]。株系PVYO可引起攜帶Ny基因的馬鈴薯發(fā)生過敏反應(yīng)，PVYC可引起攜帶Nc基因的馬鈴薯發(fā)生過敏反應(yīng)，而PVYNTN可導致馬鈴薯發(fā)生馬鈴薯塊莖壞死環(huán)斑病（Potato tuber necrotic ringspot disease，PTNRD）[8]。鑒于上述不同的病理效應(yīng)，不同PVY株系的危害程度有所差異[9-10]，檢測大田馬鈴薯感染的PVY株系情況，可為馬鈴薯檢驗檢疫提供技術(shù)依據(jù)，推動馬鈴薯種薯認證相關(guān)法規(guī)的完善和種薯檢測工作，指導選擇栽培合適的馬鈴薯品種，選用恰當?shù)拿摱痉乐渭夹g(shù)[14-15]。

目前國內(nèi)已開展一些馬鈴薯感染的PVY株系的鑒定工作[16-24]，但采樣地點的覆蓋面仍不廣，樣品數(shù)較為有限，比如黑龍江省迄今僅鑒定9份馬鈴薯病樣（見表1），其中包括1份克山樣品和1份訥河樣品的鑒定結(jié)果[24]。前期試驗對這2份病樣的鑒定利用焦磷酸測序技術(shù)已完成，這也是首次報道將焦磷酸測序技術(shù)運用于PVY株系鑒定。本文利用焦磷酸測序技術(shù)對采自黑龍江4個不同地區(qū)的16份馬鈴薯樣品的PVY株系進行鑒定，以期進一步了解黑龍江省乃至全國范圍內(nèi)大田種植的馬鈴薯感染的PVY株系情況。

表1 黑龍江省內(nèi)部分地區(qū)馬鈴薯感染PVY株系的鑒定結(jié)果Table 1 Potato virus Y strains previously identified in references with potato plant samples from different places of Heilongjiang Province in China

1 材料與方法

1.1 植物材料

分別從黑龍江省克山縣采集馬鈴薯潛在病葉樣品24份，從訥河市采集樣品18份，從五大連池市采集樣品7份，從北安市采集樣品7份。已通過焦磷酸測序證實從克山縣和訥河市采集的2份樣品感染了PVYN-Wi[24]。本文從剩余樣品中，每個地區(qū)挑選4份發(fā)病癥狀尤其明顯樣品，鑒定可能感染的PVY株系。

1.2 反轉(zhuǎn)錄引物、PCR引物和測序引物的設(shè)計

之前從NCBI庫中選取代表PVYC、PVYO、PVYN、PVYNTN、PVYNTN-NW、PVYN∶O、PVYN-Wi、PVYWilga、PVYN（W）9個株系的PVY全基因組序列30個，比對P1和CP蛋白的氨基酸序列，分別找出1個差異區(qū)段，然后找出其在基因組中的序列，針對這2個區(qū)域設(shè)計反轉(zhuǎn)錄引物（R001、R008）、PCR引物（P1-A-F1、P1-A-R-biotin、CP-B-F1和CPB-R-biotin）和測序引物（P1-A-F1，CP-B-F1），經(jīng)研究證實可用于焦磷酸測序法鑒定馬鈴薯感染的PVY株系[24]。本研究利用之前設(shè)計的反轉(zhuǎn)錄引物、PCR引物和測序引物，具體序列參見文獻[24]。所用引物均由Invitrogen公司合成。

1.3 總RNA的提取

具體操作參見文獻[24]，取馬鈴薯葉片樣品，加液氮，磨碎，用QIAGEN的RNeasyRPlant Mini Kit提取總RNA，Nanodrop紫外分光光度計（ND1000）測定RNA樣品濃度。

1.4 反轉(zhuǎn)錄

具體操作參見文獻[24]，取提取的RNA樣品，用Invitrogen的GoldScript cDNA Synthesis Kit進行反轉(zhuǎn)錄，操作按說明書進行。

1.5 PCR擴增

具體操作參見文獻[24]，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用Invitrogen公司的PCR SuperMix配制PCR反應(yīng)混合液置于Eppendorf梯度PCR儀（型號：MastercyclerRep）中進行PCR擴增。反轉(zhuǎn)錄引物R001的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用PCR引物P1-A-F1和P1-A-R-biotin進行PCR擴增。反轉(zhuǎn)錄引物R008的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用PCR引物CP-B-F1和CP-B-R-biotin進行PCR擴增。每管PCR反應(yīng)混合液含45 μL PCR SuperMix，1 μL正向引物，1 μL反向引物，3 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，總體積為50 μL。PCR程序為：95℃×5 min，45個擴增循環(huán)（95℃×15 s，63℃×30 s，72℃×18 s），72℃× 5 min。PCR擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳。63℃下退火有PCR產(chǎn)物但條帶模糊的樣品提高退火溫度繼續(xù)PCR以提高特異性。出現(xiàn)清晰條帶且長度符合預(yù)期的PCR產(chǎn)物才用于焦磷酸測序。

1.6 焦磷酸測序

測序所用試劑均購自QIAGEN公司。具體操作參見文獻[24]，每份PCR產(chǎn)物吸取5 μL加入酶標板，每孔加入40 μLBinding buffer和1 μL磁珠，室溫振搖約10 min，按儀器說明書程序抓取單鏈PCR模板。將得到的單鏈PCR模板放入已每孔加有40 μL Annealing buffer和1 μL測序引物（濃度為100 μmol·L-1）的測序板中，置于烘箱中85℃孵育2 min，取出自然冷卻至室溫后放入測序儀（PyroMark ID型焦磷酸測序儀，德國QIAGEN公司），按測序軟件計算得出的體積數(shù)值將酶混合物、底物混合物和4種dNTP加入試劑艙的指定腔室中，然后啟動程序進行焦磷酸自動測序。PCR引物P1-A-F1和P1-A-R-biotin進行PCR擴增的產(chǎn)物用測序引物P1-A-F1進行測序。PCR引物CP-B-F1和CP-B-R-biotin進行PCR擴增的產(chǎn)物用測序引物CP-B-F1進行測序。利用測序結(jié)果進行PVY株系判定的方法參見文獻[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序模板的獲取

由于PVY的基因組是1條單鏈RNA，因此需要提取RNA進行反轉(zhuǎn)錄，并進一步進行PCR擴增來獲得測序模板。本試驗中利用反轉(zhuǎn)錄引物R001結(jié)合PCR引物P1-A-F1和P1-A-R-biotin獲取P1蛋白的部分編碼區(qū)，PCR產(chǎn)物預(yù)期長度為197 bp；利用反轉(zhuǎn)錄引物R008結(jié)合PCR引物CP-B-F1和CP-B-R-biotin來獲取CP蛋白的部分編碼區(qū)，PCR產(chǎn)物預(yù)期長度為200 bp。圖1顯示退火溫度為63℃下的PCR結(jié)果。在預(yù)期長度位置有PCR產(chǎn)物但條帶模糊的樣品（如圖1中用虛線箭頭指示的1、2、6和15泳道）繼續(xù)提高退火溫度來PCR以提高特異性（因限于篇幅，進一步PCR的結(jié)果圖未展示）。出現(xiàn)清晰條帶且長度符合預(yù)期的PCR產(chǎn)物（如圖1中用實線箭頭指示的3、7、9、12、13和14泳道）用于焦磷酸測序。

2.2 焦磷酸測序結(jié)果

利用PCR擴增獲取的測序模板進行焦磷酸測序。樣品BA-003的焦磷酸測序圖見圖2。

圖2中A為PCR引物P1-A-F1和P1-A-R-biotin進行PCR擴增的產(chǎn)物用測序引物P1-A-F1進行測序的結(jié)果，B為PCR引物CP-B-F1和CP-B-R-biotin進行PCR擴增的產(chǎn)物用測序引物CP-B-F1進行測序的結(jié)果。

2.3 根據(jù)焦磷酸測序結(jié)果判定PVY株系

根據(jù)焦磷酸測序結(jié)果判定，克山1份樣品感染了PVYN:O，1份樣品感染PVYN-Wi；訥河2份樣品均感染PVYN-Wi；五大連池1份樣品感染PVYN:O，1份樣品感染PVYN-Wi；北安1份樣品感染PVYN-Wi（見表2）。這7份樣品照片見圖3，主要癥狀描述見表2。

圖1 部分測序模板的PCR結(jié)果Fig.1 PCR results for some sequencing templates

圖2 樣品BA-003的焦磷酸測序Fig.2 Pyrosequencing figures of the sample BA-003

表2 對黑龍江省的部分地區(qū)馬鈴薯樣品所感染的PVY株系的鑒定結(jié)果Table 2 PVY strains identified in this research in the potato leaf samples collected from some places of Heilongjiang Province

圖3 鑒定了PVY株系的7份馬鈴薯樣品的田間采樣Fig.3 Photos of the seven potato plant samples of this research with identified PVY strains in the fields where they were collected

3 討論與結(jié)論

利用焦磷酸測序技術(shù)從采自黑龍江省的克山、訥河、五大連池和北安地區(qū)的5份馬鈴薯樣品中鑒定出PVYN-Wi，從采自克山和五大連池的2份樣品中鑒定出PVYN:O。之前我們曾報道分別從1份克山樣品和1份訥河樣品中鑒定PVYN-Wi[24]。另有文獻報道從克山等地的3份馬鈴薯樣品中鑒定出PVYNTN[20-22]，從哈爾濱、牡丹江和集賢3份樣品中鑒定出PVYN[16,18]，從哈爾濱的1份樣品中鑒定出PVYN:O[23]。鑒定結(jié)果表明黑龍江省內(nèi)大田種植的馬鈴薯至少存在PVYN-Wi、PVYN:O、PVYNTN和PVYN這4種PVY株系侵染；而且，由于PVYN-Wi侵染了16份已鑒定病樣中的7份，而其余3種株系均僅侵染了3份病樣（表1、2），顯示PVYN-Wi可能為優(yōu)勢株系。

研究人員從山東省和安徽省的馬鈴薯樣品中鑒定出PVYO[17，19]，從河南省的馬鈴薯樣品中鑒定出PVYNW[21]，從河南省、貴州省和山西省的馬鈴薯樣品中鑒定出PVYN:O[21-22]。比較黑龍江省和黑龍江省外地區(qū)馬鈴薯樣品感染PVY株系的鑒定結(jié)果，顯示黑龍江省和黑龍江省外地區(qū)馬鈴薯感染的PVY株系既有相同（PVYN:O），也有不同（PVYO、PVYNW）。此外，本文和上述文獻報道的鑒定結(jié)果表明，我國大陸地區(qū)種植的馬鈴薯至少存在PVYN-Wi、PVYN:O、PVYNTN、PVYN、PVYO和PVYNW這6種PVY株系侵染。

之前曾報道兩份均感染了PVYN-Wi的馬鈴薯病樣的癥狀之間有明顯差異[24]，其他報道我國大陸地區(qū)PVY株系的文獻中鮮有馬鈴薯感染不同PVY株系后的癥狀描述[16-23]。本試驗中5份均感染PVYN-Wi的馬鈴薯病樣（KS-GB-002、NH-CF-001、NH-CF-004、WDLC-007、BA-003），以及2份均感染PVYN:O的馬鈴薯病樣（KS-BH-002、WDLC-003）的癥狀之間有明顯差異（見圖3），再次表明僅從馬鈴薯病葉的癥狀來判斷所感染的PVY株系非常困難。

Ogawa等研究顯示日本的馬鈴薯至少存在PVYNTN、PVYO和PVYN3種PVY株系侵染[25]；Lorenzen等研究顯示美國的馬鈴薯至少存在PVYN、PVYNTN、PVYN:O3種PVY株系侵染[26]；而Nanayakkara等研究顯示加拿大的馬鈴薯也至少存在PVYN、PVYN:O和PVYNTN3種PVY株系侵染[27]。上述國家檢出的PVY株系在我國均有檢出[17,19,21]。由于缺乏全基因組數(shù)據(jù)，尚無法判斷我國PVY株系與國外PVY株系之間的親緣關(guān)系。但是，Ogawa等對日本的PVY與其他國家相同株系PVY的全序列比較結(jié)果顯示，仍有一定的序列差別[25]，而PVY具有較強的重組能力[9]，外來序列有可能促進本土PVY重組出新的株系，因此加強PVY檢疫工作仍很有必要。

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Identification ofPotato virusY strains in infected potato plants from some places of Heilongjiang Province

LIU Hongyi1,LIANG Wusheng2,LIU Zhongmei1, ZHANG Hongxiang1,YANG Liqun1
(1.State Key Testing Laboratory of Potato Viruses of China,Technical Center of Inspection and Quarantine,Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Harbin 150001,China;2.State Key Laboratory of Rice Biology,Institute of Biotechnology,School of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

Some potato plant samples potentially infected byPotato virus Y(PVY)were collected from the fields in Keshan,Nehe,Wudalianchi and Beian of Heilongjiang Province,China.Total RNA was extracted from the leaves of the samples.Reverse transcription,PCR and pyrosequencing were carried out with the primers designed and testified previously to identify the PVY strains in the samples. The sequencing results indicated that two samples from Keshan were infected by PVYN:Oand PVYN-Wi, respectively;two samples from Nehe both were infected by PVYN-Wi;two samples from Wudalianchi were infected by PVYN:Oand PVYN-Wi,respectively;and one sample from Beian was infected by PVYN-Wi. Taken together with the PVY strains previously identified from nine potato plant samples collected from Heilongjiang Province,the research results indicated that potato plants in Heilongjiang Province had been infected by at least four PVY strains(PVYN-Wi,PVYN:O,PVYNTNand PVYN).Furthermore,as PVYN-Wiwas detected in seven of the 16 identified samples,but each of the three rest strains was only detected in three identified samples,respectively,and PVYN-Wiwas probably the predominant one of the four strains.

Heilongjiang Province;potato;Potato virus Y;virus strain identification;pyrosequencing

S532

A

1005-9369（2014）01-0047-06

2013-10-09

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2008IK242）；國家自然科學基金資助項目（30870187）

劉洪義（1966-），男，研究員，碩士，研究方向為植物檢疫。E-mail:liuhongyi665@163.com

時間2014-1-9 21:10:34[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.2110.011.html

劉洪義,梁五生,劉忠梅,等.黑龍江省部分地區(qū)馬鈴薯Y病毒株系檢測[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2014,45(1):47-52.

Liu Hongyi,Liang Wusheng,Liu Zhongmei,et al.Identification ofPotato virus Ystrains in infected potato plants from some places of Heilongjiang Province[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(1):47-52.(in Chinese with English abstract)