韋紅玉，隆昕穎，凌俊，趙麗娟②，謝振鋒，唐華英，韋連登，陳源紅，覃艷春

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣西 百色 533000

E-mail：why-825＠163.com；2.廣西百色市疾病預(yù)防控制中心，廣西 百色 533000；3.廣西百色市婦幼保健院，廣西 百色 533000）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的慢性傳染病，我國仍是22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一。近年來，我國每年報(bào)告肺結(jié)核發(fā)病人數(shù)約100萬，導(dǎo)致結(jié)核病高發(fā)病率和死亡率的重要因素之一是耐藥結(jié)核病的產(chǎn)生，耐藥肺結(jié)核有以下4種類型，單耐藥（monoresistance）：僅對1種抗結(jié)核藥物耐藥；多耐藥（polyresistance）：對1 種以上的抗結(jié)核藥物耐藥（不包括同時(shí)對異煙肼和利福平耐藥的情況）；耐多藥（Multidrug resistance，MDR）：至少對異煙肼和利福平同時(shí)耐藥；廣泛耐藥（Extensively drug-resistant，XDR）：除對異煙肼和利福平耐藥之外，同時(shí)對任意1種氟喹諾酮類藥物及對3種二線抗結(jié)核藥物注射劑（卡那霉素、丁胺卡那霉素和卷曲霉素）中的至少1種耐藥［1］。目前耐藥肺結(jié)核危害日益凸顯，每年新發(fā)患者人數(shù)約12萬，未來數(shù)年內(nèi)可能出現(xiàn)以耐藥菌為主的態(tài)勢。因此耐藥結(jié)核病一直都是臨床治療的難點(diǎn)和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)［2］。近年來世界各地結(jié)核分枝桿菌的多耐菌株逐漸增多，甚至引起暴發(fā)流行。利福平是傳統(tǒng)的抗結(jié)核一線藥物，結(jié)核分枝桿菌對利福平的耐藥機(jī)制可能是，編碼RNA 聚合酶beta亞基的rpoB 基因的突變使利福平不能與之結(jié)合，從而產(chǎn)生對利福平的耐藥［3］。目前很多預(yù)測利福平耐藥的分子檢測方法已經(jīng)建立起來［4-5］，以往研究［6-9］顯示單耐利福平菌株的rpoB基因突變多分布在“利福平耐藥決定區(qū)”（rifampin resistance determining region，RRDR），507-533 位 密 碼 子，共81 bp。

本研究擬了解百色地區(qū)耐利福平結(jié)核分枝桿菌臨床分離株rpoB基因RRDR 突變特征及其與耐藥的關(guān)系。為本地區(qū)耐藥結(jié)核的防治和制訂有效的預(yù)防及干預(yù)耐藥結(jié)核病措施提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2013年在百色市疾病控制中心結(jié)核病防治所就診的結(jié)核病痰液涂片陽性128例患者（包括百色市及百色地區(qū)各縣新發(fā)和復(fù)發(fā)患者，年齡19～88歲；男96例，女32例）的痰標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及耐藥性檢測 痰液涂片陽性細(xì)菌采用改良的羅氏培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性的菌株采用絕對濃度法進(jìn)行耐藥性檢測。

1.2.2 基因組DNA 提取和rpoB基因RRDR 的PCR 擴(kuò)增和測序 基因組DNA 采用北京andybio公司生產(chǎn)的分枝桿菌DNA 提取試劑盒（柱式）提取，rpoB基因擴(kuò)增引物為rpoB-F：5′-TACGGTCGGCGAGCTGATCC-3′，rpoB-R ：5′-TACGGCGTTTCGATGAACC-3′［10］（引 物 由 華 大 基 因 公 司合成），序列大小為411bp。PCR 擴(kuò)增采用50μl反應(yīng)體系：5 μl模板，上下游引物各1.5μl，ddH2O 17μl，2×EasyTaq PCR SuperMix 25μl（購自北京全式金生物公司）。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃變性5min；94℃變性1min，58.5℃退火1min，72℃延伸1 min；循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 DNA 序列測定與分析 PCR 產(chǎn)物交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。用BLAST 與H37RV 菌株相應(yīng)基因進(jìn)行序列比對，通過DNAman軟件判斷突變基因突變位點(diǎn)及形式。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果 從128例痰液涂片陽性標(biāo)本中分離培養(yǎng)獲得98例MTB菌株，36株對利福平耐藥。

2.2 PCR 檢測結(jié)果 提取耐藥菌株DNA 進(jìn)行PCR，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段大小一致，部分PCR 產(chǎn)物電泳圖譜見圖1。2.3 測序比對結(jié)果 36株耐藥菌株中，27株在rpoB“RRDR”區(qū)域出現(xiàn)突變，突變位點(diǎn)有4個，rpoB 單個突變位點(diǎn)突變特征，見表1。

圖1 耐藥菌株P(guān)CR 產(chǎn)物電泳圖

表1 rpoB突變位點(diǎn)突變特征

3 討論

耐利福平MTB rpoB 基因突變主要發(fā)生在“RRDR”，以531、526、516位突變最為多見。已有文獻(xiàn)報(bào)道我國北京市等8個地區(qū)MTB rpoB基因突變情況［11-12］，而百色地區(qū)尚未見類似報(bào)道。本研究檢測結(jié)核病患者痰標(biāo)本rpoB基因RRDR 突變及其性質(zhì)，為在我地區(qū)建立快速檢測耐利福平結(jié)核病基因診斷技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)98 例 MTB 出現(xiàn)36 株利福平耐藥，耐藥率為36.73%，檢測耐藥菌rpoB基因序列，36株耐利福平菌株中有27株rpoB基因發(fā)生突變，基因突變率為75.00%，與貴州省遵義 地 區(qū)rpoB 基 因 突 變 率 相 似［11］，其 中516 位 點(diǎn) 突 變 率為3.70%（1／27），531 位 點(diǎn) 突 變 率 為59.26%（16／27），526 位點(diǎn)突變率為29.63%（8／27），533位點(diǎn)突變率為7.41%（2／27）。與常規(guī)藥敏實(shí)驗(yàn)相符。531位點(diǎn)突變率與東部地區(qū)rpoB531突變頻率（61.2%）［13］及中部地區(qū)rpoB531突變頻率（58%）［14］研究結(jié)果相近，該研究中較高的rpoB531 突變頻率也可能是由于耐藥菌株對于rpoB531的選擇壓力造成的［15］。有報(bào)道，531位和526位是最常見的突變位點(diǎn)，且531多于526［16］，與本地區(qū)的rpoB基因突變結(jié)果一致，但也有報(bào)道，526位突變頻率高于531位突變頻率［3，17］，另本實(shí)驗(yàn)未出現(xiàn)已報(bào)道的522、550、511、513突變位點(diǎn)，說明rpoB基因突變位點(diǎn)在我國有一定的地域差異。本實(shí)驗(yàn)說明百色地區(qū)耐利福平結(jié)核分枝桿菌耐藥性的產(chǎn)生主要是因?yàn)閞poB 的531 位點(diǎn)密碼子發(fā)生改變，其次是526位點(diǎn)密碼子發(fā)生改變，與蘇州市、廣東省、河南省等地突變特征相似［10，18-19］，進(jìn)一步闡明利福平耐藥機(jī)制主要與基因突變有關(guān)，特別是與531位點(diǎn)突變相關(guān)。9株未發(fā)生突變與常規(guī)藥敏實(shí)驗(yàn)不符，說明利福平耐藥性的產(chǎn)生可能還有其它耐藥機(jī)制或常規(guī)藥敏實(shí)驗(yàn)也有誤差，或是患者對MTB發(fā)揮免疫防御過程中患者自身遺傳易感性及免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的打破使機(jī)體不能清除MTB而導(dǎo)致耐藥［20］。

總之，本研究首次采用DNA 序列測定技術(shù)分析百色地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐利福平rpoB 基因的突變特征，為開發(fā)結(jié)核分枝桿菌耐藥性分子檢測方法和闡明MTB利福平耐藥機(jī)制積累了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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