陳淑敏，鄒宗楷，唐忠輝，沈洪武，蘇海燕，陳雅靜，林彩環(huán)

（1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院病理學(xué)教研室，福建 漳州 363000 E-mail：chensm1705＠163.com；2.福建省漳州市醫(yī)院病理科，福建 漳州 363000）

胃癌是我國最常見的消化道腫瘤，其發(fā)病率居各類腫瘤的首位。胃癌的發(fā)生發(fā)展是多基因改變的結(jié)果。尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄 因 子2（caudal type homeobox transcription factor-2，CDX2），屬腸特異性轉(zhuǎn)錄因子，對腸上皮細(xì)胞的分化、凋亡和腸道特定基因的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。黏蛋白2（mucin 2，MUC2）是MUC2基因編碼的一種分泌性黏蛋白，主要功能是在腸腔的上皮表面形成保護(hù)屏障?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)CDX2和MUC2在胃黏膜腸化生及胃癌組織中表達(dá)異常［1］。本實驗采用組織芯片技術(shù)構(gòu)建101例組織芯片，用免疫組化方法（S-P 法）檢測組織芯片中CDX2和MUC2的表達(dá)，旨在探討他們的表達(dá)與萎縮性胃炎及胃癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取漳州市醫(yī)院病理科2002年7月～2003年1月期間隨訪資料完整的41例原發(fā)性胃癌手術(shù)切除標(biāo)本的蠟塊及30例萎縮性胃炎標(biāo)本蠟塊。另胃鏡活檢選取30例正常胃黏膜作為對照。復(fù)習(xí)全部病例的臨床資料，胃癌病例按新編常見惡性腫瘤診治規(guī)范進(jìn)行組織分型、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分站及TNM 分期。其中乳頭狀腺癌6例、管狀腺癌17例、低分化腺癌6例、黏液腺癌7例、印戒細(xì)胞癌1例。所有患者術(shù)前未經(jīng)過任何抗癌治療。

1.2 主要試劑 實驗用兔抗人CDX2 單克隆抗體（克隆號：EPR2764Y，即用型，產(chǎn)品編號：RMA-0631）、鼠抗人MUC2單克隆抗體（克隆號：M53，即用型，產(chǎn)品編號：MAB-0075）及SP免疫組化試盒及DAB顯示試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 組織芯片制作 步驟一：HE 染色切片形態(tài)學(xué)觀察，確定目標(biāo)組織：萎縮性胃炎的胃黏膜、胃癌等。步驟二：選擇目標(biāo)組織并分別在組織切片和相應(yīng)石蠟組織上標(biāo)記。步驟三：依次制作取材針、組織芯片制孔器和7×5和7×6點(diǎn)列陣的組織芯片受體模塊［2］；用取材針從已定位的石蠟上取目標(biāo)組織到組織芯片受體蠟塊的相應(yīng)孔內(nèi)，構(gòu)建含有正常胃黏膜、萎縮性胃炎及胃癌的組織陣列蠟塊。步驟四：將組織陣列蠟塊行連續(xù)切片，切片厚度為4μm，與常規(guī)組織制片操作基本相似。

1.4 免疫組化 采用S-P方法對組織芯片切片進(jìn)行免疫組化染色，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片，具體操作按照SP 試劑盒說明書進(jìn)行。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，用腸黏膜組織切片作陽性對照。

1.5 染色結(jié)果判斷 染色結(jié)果采用半定量分析法：以染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比綜合計分。CDX2蛋白表達(dá)陽性為胞核出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒。MUC2蛋白表達(dá)陽性為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒。染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性（染色深淺需與背景著色相對比）計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比即某類細(xì)胞5個視野（每400×高倍視野計數(shù)100個此類細(xì)胞）的陽性細(xì)胞平均數(shù)：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。每張切片隨機(jī)取5個400倍視野，每個視野均進(jìn)行染色強(qiáng)度計分與陽性細(xì)胞百分比計分。采用雙盲法，分別由兩位資深病理醫(yī)師觀察計分，取二者的平均評分作為每張切片的染色強(qiáng)度分值和陽性細(xì)胞百分比計分。最終評分為染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（＋），5～8分為中度陽性（＋＋），9～12分為強(qiáng)陽性（＋＋＋）。1～12分在文中都描述為陽性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，陽性率以%表示。采用行×列表χ2檢驗，Spearman 秩相關(guān)檢驗。P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片的質(zhì)量 構(gòu)建含30例正常胃黏膜、30例萎縮性胃炎和41例胃癌患者的組織芯片，30例萎縮性胃炎和41例胃癌患者的組織芯片。蠟塊組織陣列排列整齊，常規(guī)切片組織形態(tài)良好。在101例組織芯片中有7例發(fā)生取材定位不準(zhǔn)、掉片和皺折現(xiàn)象，其中胃癌4 例、正常胃黏膜2 例、萎縮性胃炎1例。41例胃癌中只有1例印戒細(xì)胞癌，故剔除掉?？偣?例芯片在結(jié)果分析時未納入統(tǒng)計。

2.2 CDX2和MUC2在正常胃黏膜、萎縮性胃炎和胃癌組織中的表達(dá)情況 在正常情況下，CDX2表達(dá)于腸黏膜上皮細(xì)胞的胞核，染色呈棕黃色。MUC2主要表達(dá)于腸道的杯狀細(xì)胞的胞質(zhì)中，染色呈棕黃色。本實驗發(fā)現(xiàn)在正常胃黏膜中CDX2、MUC2無表達(dá)（見圖1A 和圖1B）。在29例萎縮性胃炎組織中CDX2全部表達(dá)陽性（100%），MUC2表達(dá)陽性21例（72.41%）（見圖2A 和圖2B）。在胃癌組織中CDX2陽性染色主要定位于細(xì)胞核，其陽性表達(dá)率為66.67%（見圖3A）。在胃癌組織中MUC2主要定位于胞質(zhì)，其陽性表達(dá)率為13.89%（見圖3B）。CDX2、MUC2在不同胃黏膜陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表1。

表1 CDX2和MUC2在不同胃黏膜病變中的表達(dá)

圖1A 正常胃黏膜CDX2免疫組化結(jié)果（S-P法×100）

圖1B 正常胃黏膜MUC2免疫組化結(jié)果（S-P法×100）

圖2A 萎縮性胃炎伴腸化生CDX2免疫組化結(jié)果（S-P法×200）

圖2B 萎縮性胃炎伴腸化生MUC2免疫組化結(jié)果（S-P法×200）

圖3A 胃癌黏膜CDX2免疫組化結(jié)果（S-P法×400）

圖3B 胃癌黏膜MUC2免疫組化結(jié)果（S-P法×200）

2.3 CDX2和MUC2蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 通過統(tǒng)計學(xué)分析表明，CDX2在男女性別表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。CDX2 表 達(dá) 在 低 分 化 腺 癌 陽 性 率 最高（83.33%），在管狀腺癌陽性率最低（58.82%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。CDX2在高中分化程度組的陽性表達(dá)率為55%，低分化程度組陽性表達(dá)率為81.25%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。MUC2在低分化腺癌陽性表達(dá)率為33.33%，黏液腺癌陽性表達(dá)率為42.86%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。在高中分化程度組的陽性表達(dá)率為0，低分化程度組陽性率31.25%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。CDX2和MUC2在胃癌組織中的表達(dá)與病人年齡、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期均無關(guān)（P ＞0.05）。以上結(jié)果見表2。

2.4 CDX2和MUC2蛋白表達(dá)的相關(guān)性 在萎縮性胃炎黏膜中CDX2表達(dá)陽性率為100%，MUC2表達(dá)陽性率為72.40%，二者無明顯相關(guān)性。在胃癌組織中MUC2陽性表達(dá)的病例都發(fā)生在CDX2陽性表達(dá)的病例中，但二者無明顯相關(guān)性（r ＝0.284，P ＝0.093），以上結(jié)果見表3。

2.5 CDX2和MUC2蛋白共同表達(dá)與胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系 CDX2和MUC2表達(dá)陽性者共5例，全部累及肌層甚至達(dá)漿膜層，全部有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，3例TNM 分期為Ⅲ期或Ⅳ期。CDX2（＋）／MUC2（-）者共19例，累及肌層甚至達(dá)漿膜層13例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有18例，10例TNM 分期為Ⅲ期或Ⅳ期。CDX2（-）／MUC2（-）者共12例，累及肌層甚至達(dá)漿膜層9例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有11例，8例TNM 分期為Ⅲ期或Ⅳ期。以上結(jié)果見表4。

3 討論

本實驗采用組織芯片技術(shù)，具有高通量的優(yōu)點(diǎn)，提高實驗效率；使實驗對照平行化，減少實驗誤差。實驗中使用自制的組織芯片制孔器制作受體蠟塊，一次制孔完成，省時省力，減少了實驗費(fèi)用。

本實驗發(fā)現(xiàn)CDX2在不同胃黏膜陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.001）。CDX2在正常胃黏膜上皮中不表達(dá)，在萎縮性胃炎中全部表達(dá)陽性（100%），與文獻(xiàn)結(jié)果相似［3］，可能與所選取病例都是萎縮性胃炎伴腸上皮化生有關(guān)。切片觀察發(fā)現(xiàn)陽性表達(dá)都發(fā)生于腸化生的杯狀細(xì)胞，提示CDX2的表達(dá)是發(fā)生胃黏膜腸化生的重要起始事件，而萎縮性胃炎伴腸上皮化生是胃癌的癌前病變。正常胃黏膜上皮沒有CDX2表達(dá)，但胃癌中卻有較高表達(dá)，并與分化程度無關(guān)，提示CDX2可能具有區(qū)分非腫瘤性和腫瘤性胃黏膜上皮的潛能。在胃癌黏膜組織中CDX2的表達(dá)低于萎縮性胃炎，考慮CDX2基因的突變可能導(dǎo)致CDX2表達(dá)缺失，最終導(dǎo)致胃癌的發(fā)生［4］。另外，本實驗結(jié)果與朱惠君等［5］相似，發(fā)現(xiàn)CDX2 異常表達(dá)與組織學(xué)分型、年齡、臨床病理分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)CDX2的陽性表達(dá)有男女差別，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，考慮：①本實驗的病例數(shù)較少，應(yīng)增加標(biāo)本數(shù)減少偏差；②CDX2表達(dá)確實與性別有關(guān)，是否與不同性別基因易感性不同有關(guān)，具體機(jī)制需要進(jìn)一步探討。

表2 CDX2和MUC2的表達(dá)及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 胃癌組織CDX2和MUC2表達(dá)的相關(guān)性

表4 胃癌CDX2、MUC2共同表達(dá)與胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系 （n，%）

本實驗發(fā)現(xiàn)MUC2在不同胃黏膜陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意 義（P ＜0.001）。MUC2 蛋 白 表 達(dá) 于 萎 縮 性 胃炎（72.41%），可能與MUC2蛋白在上皮更新分化方面具有重要作用有關(guān)。胃癌中黏液腺癌和低分化腺癌MUC2陽性率高，與陳亞男等［6］、南則仲等［7］研究結(jié)果相似，認(rèn)為MUC2可作為研究黏液腺癌的較好指標(biāo)。MUC2的表達(dá)與分化程度有關(guān)，主要表達(dá)于低分化程度組。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)MUC2在胃癌組織中的表達(dá)與浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期均無關(guān)，考慮腫瘤的遷移與擴(kuò)散可能是多因素綜合作用的結(jié)果，可能與Survivin、CD147和CD34 等異常表達(dá)有關(guān)［8］。

本實驗發(fā)現(xiàn)不論在萎縮性胃炎或胃癌組織中CDX2 和MUC2的表達(dá)無明顯相關(guān)性，與文獻(xiàn)報道不一致［9-10］。Yamamoto等［11］認(rèn)為CDX2蛋白可能通過作用于MUC2基因的啟動子，上調(diào)MUC2 mRNA 的活性，共同參與胃黏膜腸化。本研究認(rèn)為CDX2的表達(dá)可影響MUC2的表達(dá)，但還有其他因素共同調(diào)控和決定MUC2 的表達(dá)，具體機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

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