閆鵬，喬嫻，劉金玲，孫圣剛，鄭瑾

YC-1對Aβ寡聚體毒性的保護作用及其相關機制

閆鵬，喬嫻，劉金玲，孫圣剛，鄭瑾

目的：探討YC-1針對 Aβ寡聚體（ADDLs）毒性的保護作用及其相關機制。方法：原代培養(yǎng)小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng)體系，應用不同濃度ADDLs（500 nmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）干預以模擬體外AD模型，應用YC-1對此模型進行干預，以CCK-8法檢測細胞活力，Western blot檢測NICD及缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）水平，采用real-time PCR檢測Caspase-3 mRNA水平。結(jié)果：濃度≥2 μmol/L的ADDLs干預明顯降低混合培養(yǎng)體系細胞活力水平，并呈現(xiàn)濃度依賴性（＜0.01）。10 μmol/L ADDLs持續(xù)干預4 h顯著降低細胞活力（＜0.01），YC-1可明顯拮抗這種毒性作用（＜0.01）。10 μmol/L ADDLs持續(xù)干預4 h明顯上調(diào)NICD及HIF-1α水平（＜0.01），YC-1可拮抗這種提高（＜0.05或0.01）。10 μmol/L ADDLs干預4 h顯著提高Caspase-3的mRNA水平（＜0.01），YC-1可顯著抑制這種上調(diào)（＜0.05）。結(jié)論：ADDLs表現(xiàn)出對原代培養(yǎng)小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng)體系的毒性作用，YC-1可發(fā)揮保護作用。

YC-1；Aβ寡聚體；保護作用；NICD；缺氧誘導因子-1α

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是老年期癡呆的主要類型，β淀粉樣蛋白（Amyloid β protein，Aβ）沉積是其主要的病理特征之一，這同時也是AD較為公認的發(fā)病機制假說之一。目前越來越多的研究表明，Aβ寡聚體（Aβ-derived diffusible ligands，ADDLs）為主要的毒性形式，在AD的發(fā)病中扮演重要角色[1]。缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是缺氧條件下呈高表達的一種蛋白分子，對細胞或組織的缺氧狀態(tài)有一定的保護作用[2]。目前HIF-1α在AD中的研究較少，且結(jié)論缺乏一致性[3,4]。同時有研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α與Notch-1信號通路之間存在交互作用[5,6]。YC-1因抑制HIF-1α表達及影響HIF-1α穩(wěn)定性，而表現(xiàn)出潛在的抗腫瘤特性[7]。本研究基于ADDLs對原代培養(yǎng)小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng)體系的毒性作用，探討YC-1針對這種毒性作用所發(fā)揮的保護性作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生0～2 d乳小鼠購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12（1∶1）、胎牛血清購自美國Hyclone公司；F12培養(yǎng)基、Neurobasal及B27購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自美國SAB公司；Aβ1-42及YC-1購自美國Sigma公司；六氟異丙醇（Hexafluoroisopropanol，HFIP）、甘油醛 -3-磷 酸 脫 氫 酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗體、GFAP抗體、MAP2抗體購自美國Santa Cruz公司；Notch-1抗體購自美國Epitomic公司；HIF-1α抗體購自美國Ebioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 ADDLs制備 依文獻報道[8]制備ADDLs：冰上將 Aβ1-42溶于 HFIP至1 mmol/L，室溫置1 h，后于4℃通風櫥內(nèi)使溶劑充分揮發(fā)至干燥膜狀，－80℃保存。使用前以DMSO溶解干燥的膜狀藥物至5 mmol/L，充分振蕩溶解，以4℃無酚紅的F12培養(yǎng)基進一步溶解藥物至100 μmol/L，4℃孵育過夜。14 000g離心10 min，留取上清即為ADDLs的F12溶液，BCA法測定蛋白濃度。鑒于ADDLs的異質(zhì)性，其摩爾濃度為其相應初始Aβ1-42單體蛋白的摩爾濃度（一般ADDLs的產(chǎn)率大概為55%～75%）。

1.2.2 小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞混合體系的原代培養(yǎng) 新生小鼠經(jīng)酒精消毒后置于超凈臺中，解剖分離大腦半球皮質(zhì)，剝除腦膜并剪碎后經(jīng)消化、終止消化、吹打、過濾、離心、重懸等步驟后至均勻單細胞懸液，計數(shù)，接種于預先經(jīng)多聚賴氨酸包被的孔板中。細胞培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)2～6 h后全量更換維持培養(yǎng)基（含2%體積B27的Neurobasal），后每周予1/3量更換維持培養(yǎng)基。

1.2.3 免疫熒光法查看混合培養(yǎng)體系 原代培養(yǎng)至第7天，終止培養(yǎng)，全量吸棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3遍，先后經(jīng)歷甲醛固定、穿孔、封閉、一抗[GFAP抗體（1∶150）]孵育、二抗孵育、第二種一抗[MAP2抗體（1∶200）]孵育、二抗孵育等系列步驟，期間間隔數(shù)次PBS漂洗，后于倒置熒光顯微鏡下激發(fā)相應的熒光并觀察拍照。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞活力 接種于96孔板的原代培養(yǎng)混合體系至第7天，給予不同濃度ADDLs（500 nmol/L及1、2、5、10、20 μmol/L）干預4 h，同時設置空白對照，每組分別設置5個副孔。于干預終點前2 h在各實驗孔加入CCK-8試劑10 μL/孔，繼續(xù)孵育2 h后于酶標儀上檢測450 nm吸光值。以“相應實驗孔吸光值－無細胞空白對照孔平均吸光值”為最終指標進行相應分析。據(jù)此選擇后續(xù)ADDLs干預濃度。

1.2.5 Western blot檢測 HIF-1α、NICD（Notch-1 intracellular domain）蛋白表達 6孔板所培養(yǎng)原代混合體系第7天，給予10 μmol/L ADDLs分別干預2、4、8、12、24 h，并同時設置空白對照。于干預終點將各培養(yǎng)孔中的細胞分別收集并RIPA裂解法提取總蛋白。以BCA法檢測蛋白濃度。按照既定流程進行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗[Notch-1（1∶200），HIF-1α（1∶800）]孵育、HRP標記二抗（1∶5 000）孵育等系列步驟后ECL法顯像，X光膠片顯影、定影。以GAPDH蛋白為內(nèi)參。BandScan分析膠片灰度值。每批次實驗重復5次。

1.2.6 YC-1干預對原代培養(yǎng)混合體系的影響 接種于96孔板的原代培養(yǎng)混合體系至第7天，給予10 μmol/L ADDLs或10 μmol/L ADDLs+10 μmol/L YC-1干預，同時設置空白對照，分別干預4、24 h。①檢測細胞活力：于干預終點前2 h行CCK-8法檢測相應的細胞活力。②Western blot檢測蛋白表達：于干預終點進行總蛋白抽提及相應蛋白表達水平的檢測。③Real-time PCR檢測Caspase-3 mRNA水平：于干預終點終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)基并PBS漂洗后以Trizol法提取混合體系細胞總RNA，并進行含量和純度測定。按照既定流程進行反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR。Caspase-3引物為 F（5'-TCTGACTGGAAAGCCGAAAC-3'）；R（5'-GACTGGATGAAC CACGACCC-3'），產(chǎn)物204 bp。應用△CT法分析結(jié)果。同時對擴增產(chǎn)物進行3%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中獲取圖像，驗證目的基因片段的大小。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 細胞免疫熒光染色

原代培養(yǎng)混合體系體外培養(yǎng)第7天，小鼠皮質(zhì)細胞MAP-2、GFAP染色陽性，見圖1。

圖1 倒置熒光顯微鏡觀察原代培養(yǎng)小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞混合體系（×400）

2.2 不同濃度ADDLs干預后細胞活力

低濃度ADDLs對混合體系的細胞活力無影響；ADDLs濃度≥2 μmol/L時，對細胞活力有顯著損害，且損害程度與ADDLs濃度呈明顯的正相關（＜0.01），見圖2。10 μmol/L ADDLs作用4 h可使細胞活力下降約40%，基于本部分實驗，筆者選取10 μmol/L作為后續(xù)實驗中ADDLs的干預濃度。

2.3 ADDLs對原代培養(yǎng)混合體系中HIF-1α及NICD水平的影響

圖2 不同濃度ADDLs干預4 h對細胞活力的影響（n=5）

10 μmol/L ADDLs干預后原代培養(yǎng)混合體系中的HIF-1α及NICD水平顯著上調(diào)，且隨干預時間的延長二者均呈現(xiàn)先升高后降低的類似總體趨勢，二者的高峰水平均出現(xiàn)在ADDLs干預后8 h，之后表達呈減低趨勢，在24 h，HIF-1α蛋白水平尚未降至與空白對照一致的水平，但NICD在24 h的表達水平與空白對照無明顯差異，見圖3。

圖3 10 μmol/L ADDLs干預不同時長對HIF-1α（A）及NICD（B）水平的影響（n=5）

2.4 YC-1對ADDLs干預下原代培養(yǎng)混合體系細胞活力的影響

圖4 YC-1對ADDLs干預4 h（A）和24 h（B）細胞活力的影響（n=5）

2.5 YC-1對ADDLs干預下原代培養(yǎng)混合體系HIF-1α及NICD水平的影響

ADDLs干預4 h后，原代培養(yǎng)混合體系的NICD及HIF-1α水平均明顯升高（＜0.01），同時應用YC-1可顯著抑制NICD及HIF-1α水平的升高（＜0.05或0.01）；ADDLs干預24 h后，原代培養(yǎng)混合體系的HIF-1α較空白對照升高（＜0.01），但升高幅度較4 h明顯減弱，NICD升高程度較4 h類似，同時應用YC-1對HIF-1α水平升高無明顯影響，下調(diào)ADDLs干預造成的NICD水平升高（＜0.01），見圖5。

圖5 YC-1對ADDLs干預4 h（A）和24 h（B）HIF及NICD表達水平的影響（n=5）

2.6 YC-1對ADDLs干預下原代培養(yǎng)混合體系Caspase-3 mRNA水平的影響

干預4 h后，10 μmol/L ADDLs顯著提高 Caspase-3的 mRNA水平（＜0.01），同時應用YC-1可抑制Caspase-3 mRNA水平的上調(diào)（＜0.05）；干預24 h后，10 μmol/L ADDLs顯著提高 Caspase-3 mRNA水平（＜0.01），YC-1并未對Caspase-3 mRNA水平的升高產(chǎn)生明顯影響，見圖6。

3 討論

既往研究提示HIF-1α水平異常升高在AD發(fā)病中可能扮演重要角色[3,4]。本研究據(jù)此應用ADDLs對原代培養(yǎng)小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞混合體系進行干預以模擬體外AD模型。既往關于評估ADDLs作用的研究基本都是采用單一種類的純凈細胞[4,8,9]。然而腦組織是神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞等共同組成的有機整體，其中星形膠質(zhì)細胞占膠質(zhì)細胞的絕大部分，且數(shù)量遠大于神經(jīng)元。鑒于此，本研究采用原代培養(yǎng)小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞混合體系，以期更大程度接近在體情況。

CCK-8實驗顯示低濃度ADDLs對原代培養(yǎng)混合體系的細胞活力無顯著影響，ADDLs干預濃度≥2 μmol/L時，4 h的干預顯著降低細胞活力，且降低程度與ADDLs濃度呈明顯的正相關，這與既往研究基本一致[8]。隨后，隨著10 μmol/L ADDLs干預時間的延長，HIF-1α及NICD水平均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，二者的變化趨勢大體一致。NICD為Notch-1受體剪切后的細胞內(nèi)活性形式，其蛋白水平可在一定程度上反映Notch-1信號通路的活性水平[10]。這提示在ADDLs對原代培養(yǎng)混合體系的毒性作用中HIF-1α及Notch-1信號通路可能存在著某種關聯(lián)。既往Schubert等[4]應用純凈的星形膠質(zhì)細胞發(fā)現(xiàn)Aβ可一過性上調(diào)HIF-1α蛋白水平繼而下降，最高峰值出現(xiàn)在Aβ干預4 h，在24 h時HIF-1α水平已降至低于空白對照的水平。本研究中ADDLs誘導的HIF-1α上調(diào)高峰值出現(xiàn)在干預后8 h，雖然之后亦呈現(xiàn)出下降的趨勢，但24 h時HIF-1α水平仍高于空白對照組，對比分析這種差異可能與神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞之間的相互作用有關，相關機理有待進一步深入探討。

圖6 YC-1對ADDLs干預4 h（A）和24 h（B）Caspase-3 mRNA水平的影響（n=5）

在干預 4 h，YC-1表現(xiàn)出針對ADDLs毒性的保護作用，但在24 h卻未表現(xiàn)出顯著的效果，顯示YC-1的保護作用和ADDLs的干預時間有關?？紤]到Aβ聚合的時間依賴性進程[9]，筆者分析ADDLs在4 h孵育過程中可保持相對穩(wěn)定的濃度，而24 h ADDLs濃度或許已由于持續(xù)37℃孵育聚合為纖維狀Aβ而大幅降低，此刻針對ADDLs毒性低微的情況YC-1即不表現(xiàn)出顯著的保護性作用?？紤]到既往研究發(fā)現(xiàn) HIF-1α可能與Notch-1信號通路存在交互作用，本研究同時檢測HIF-1α及NICD的蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 4 h，YC-1可同時降低ADDLs所誘導的HIF-1α及NICD水平上調(diào)，而24 h YC-1對ADDLs所誘導HIF-1α及NICD水平上調(diào)并未表現(xiàn)出顯著的影響。這提示YC-1所表現(xiàn)出的保護性作用與其抑制HIF-1α及NICD水平上調(diào)相關，同時還提示在ADDLs的毒性作用中HIF-1α及Notch-1信號通路存在相互作用。

Avramovich-Tirosh等[11]發(fā)現(xiàn)，利用M30激活HIF-1α及其調(diào)控基因可降低Aβ25-35的毒性，提示本研究中ADDLs所誘導的HIF-1α一過性上調(diào)可能為一種自我保護機制，但另一方面HIF-1α的上調(diào)同時又和Notch-1信號通路相互作用，對神經(jīng)細胞產(chǎn)生有害的影響。Li等[12]反復用低氧處理SH-5Y細胞之后誘導Aβ增加，同時低氧會上調(diào)HIF-1α水平，而Aβ的增加反之又會進一步誘導HIF-1α上調(diào)，從而可能形成一種“惡性循環(huán)”，這提示YC-1的保護作用可能是干預了這種“惡性循環(huán)”。

綜上，本研究提示ADDLs的毒性作用與HIF-1α上調(diào)及Notch-1信號通路異?；罨芮邢嚓P，且HIF-1α與Notch-1信號通路的相互作用在ADDLs的毒性作用中可能發(fā)揮重要作用，其中HIF-1α可能發(fā)揮雙面作用。另外，針對ADDLs的毒性作用，YC-1可能通過“抑制HIF-1α上調(diào)”及“抑制Notch-1信號通路的異常活化”發(fā)揮其保護作用，其中具體相關機理仍需進一步深入探討。

[1]Cheng IH,Scearce-Levie K,Legleiter J,et al. Accelerating amyloid-β fibrillization reduces oligomerlevels and functionaldeficits in Alzheimer disease mouse models[J].J Biol Chem,2007,282:23818-23828.

[2]Hashmi S,Al-Salam S.Hypoxia-inducible factor-1 alpha in the heart:a double agent?[J]. Cardiol Rev,2012,20:268-273.

[3]Soucek T,Cumming R,Dargusch R,et al. The regulation of glucose metabolism by HIF-1 mediates a neuroprotective response to amyloid beta peptide[J].Neuron,2003,39:43-56.

[4]Schubert D,Soucek T,Blouw B.The induction of HIF‐1 reduces astrocyte activation by amyloid beta peptide[J].Eur J Neurosci,2009, 29:1323-1334.

[5]Du R,Sun W,Xia L,et al.Hypoxia-induced down-regulation ofmicroRNA-34a promotes EMT by targeting the Notch signaling pathway in tubular epithelial cells[J].PloS one,2012,7: e30771.

[6]Gao W,Sweeney C,Connolly M,et al. Notch-1 mediates hypoxia-induced angiogenesis in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheumatism, 2012,64:2104-2113.

[7]Tsui L,Fong TH,Wang IJ.YC-1 targeting of hypoxia-inducible factor-1αreduces RGC-5 cell viability and inhibits cell proliferation[J].Mol Vis,2012,18:1594-1603.

[8]Zhou Y,Klein WL.AβOligomers-induced toxicity is attenuated in cells cultured with NbActiv4?medium [J].Neurotox Res,2012,22: 335-344.

[9]Prangkio P,Yusko EC,Sept D,et al.Multivariate analyses of amyloid-beta oligomer populations indicate a connection between pore formation and cytotoxicity[J].PloS one,2012,7: e47261.

[10]Ables JL,Breunig JJ,Eisch AJ,et al.Not (ch)just development:Notch signalling in the adult brain [J].Nat Rev Neurosci,2011,12: 269-283.

[11]Avramovich-Tirosh Y,Bar-Am O,Amit T, et al.Up-regulation of hypoxia-inducible factor (HIF)-1 and HIF-target genes in cortical neurons by the novel multifunctional iron chelator anti-Alzheimer drug,M30[J].Curr Alzheimer Res, 2010,7:300-306.

[12]Li L,Zhang X,Yang D,et al.Hypoxia increases Aβgeneration by alteringβ-andγ-cleavage of APP [J].Neurobiol Aging,2009,30: 1091-1098.

Protective Effect of YC-1 Against ADDLs-induced Toxicity and HIF-1α Related Mechanism

Objective:To study the protective effect of YC-1 against ADDLs(Aβ oligomers)-induced toxicity and related mechanism.Methods:Different concentrations (500 nmol/L,1 μmol/L,2 μmol/L,5 μmol/L, 10 μmol/L,20 μmol/L)of ADDLs were used to intervene the primary co-culture system of mouse cortical neurons and astrocytes,and YC-1 was applied at the same time.CCK-8 assays were used to assess cell vitality of co-culture cells.NICD and HIF-1α levels of primary co-culture system were assessed with western blot,and real-time PCR was used to detect apoptosis associated Caspase-3 mRNA level of co-culture system.Results: ADDLs at≥2 μmol/L reduced the cell viability of the co-culture system in a concentration-dependent manner (＜0.01).Exposure to 10 μmol/L ADDLs for 4 hours showed obvious toxic effect on the co-culture system(＜0.01),while the application of YC-1 significantly attenuated the toxic effect induced by ADDLs(＜0.01).The NICD and HIF-1α levels were up-regulated after the exposure of 10 μmol/L ADDLs for 4 hours(＜0.01),while the application of YC-1 significantly attenuated the up-regulation of the protein levels(＜0.05 or 0.01).The Caspase-3 mRNA level was increased after intervened by 10 μmol/L ADDLs for 4 hours(＜0.01),and YC-1 significantly inhibited the increase (＜0.05).Conclusion:The toxic effect induced by ADDLs on primary co-culture system of mouse cortical neurons and astrocytes could be protected by YC-1.

YC-1;Aβ-derived diffusible ligands;protective effect;NICD;hypoxia-inducible factor-1α

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.002

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢430022

國家自然科學基金青年基金（No.81301085）

2013-12-31

鄭瑾wickey4083@gmail. com