崔梅，楊琦，董強(qiáng)

Mdivi-1對(duì)糖氧剝奪后神經(jīng)元凋亡蛋白Bax活化、嵌入及細(xì)胞色素C釋放的影響

崔梅，楊琦，董強(qiáng)

目的：研究線粒體分裂蛋白抑制劑Mdivi-1對(duì)糖氧剝奪（OGD)后神經(jīng)元凋亡蛋白Bax活化、嵌入及細(xì)胞色素C（CytC）釋放的影響。方法：體外培養(yǎng)原代皮質(zhì)神經(jīng)元并制備OGD模型，采用不同濃度的Mdivi-1干預(yù)細(xì)胞，MTT測(cè)定神經(jīng)元存活率。之后采用10μmol/LMdivi-1干預(yù)細(xì)胞，免疫共沉淀或細(xì)胞堿處理后測(cè)定細(xì)胞凋亡蛋白Bax的活化和嵌入情況。抽提線粒體和細(xì)胞漿蛋白，Western Blot測(cè)定線粒體內(nèi)CytC釋放情況。結(jié)果：Mdivi-1可以劑量依賴地改善OGD后神經(jīng)細(xì)胞的存活，10μmol/LMdivi-1干預(yù)可以減少凋亡蛋白Bax的激活和嵌入，并且減少CytC的釋放。結(jié)論：線粒體分裂蛋白抑制劑Mdivi-1在OGD后具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能和其抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

氧糖剝奪；神經(jīng)元；線粒體；凋亡蛋白Bax；細(xì)胞色素C

dong_qiang@fudan.edu.cn

線粒體功能障礙與諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病之間有著深入的聯(lián)系，其中線粒體動(dòng)力學(xué)機(jī)制和線粒體分裂融合失衡為眾人所關(guān)注。目前有研究報(bào)導(dǎo)，在眾多神經(jīng)變性疾病和缺血性腦血管病中，線粒體存在動(dòng)力學(xué)障礙和過度分裂的現(xiàn)象。抑制線粒體分裂蛋白Drp1是一種潛在的腦缺血治療靶點(diǎn)[1-3]。近期的研究表明在體外模型中Drp1的小分子抑制劑Mdivi-1可預(yù)防由谷氨酸引起的線粒體片段化、線粒體膜電位崩解和細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種小分子抑制劑可以減輕谷氨酸和缺血損傷引起的毒性和梗死體積，這顯示線粒體分裂蛋白Drp1在急性缺血性損傷中扮演重要角色[4]。線粒體在細(xì)胞凋亡過程中的核心作用已得到廣泛認(rèn)可。線粒體的融合分裂與細(xì)胞凋亡也存在密切關(guān)系，在多種細(xì)胞凋亡的模型中都發(fā)現(xiàn)線粒體的過度分裂。有研究表明，線粒體的過度分裂發(fā)生在凋亡早期，大概與凋亡蛋白Bax從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位到線粒體同時(shí)，早于凋亡因子Caspase的釋放。而線粒體分裂蛋白Drp1過度表達(dá)可促進(jìn)線粒體的分裂及細(xì)胞色素C（cytochrome C，CytC）的釋放，表明Drp1在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[5,6]。本研究在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中制備糖氧剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）的細(xì)胞模型，采用Drp1的小分子抑制劑Mdivi-1干預(yù)細(xì)胞，檢測(cè)Mdivi-1對(duì)腦缺血后線粒體凋亡蛋白Bax寡聚、嵌入及線粒體外膜通透性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生SD大鼠購自復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑與儀器 Neurobasal A、DMEM、胎牛血清均購自美國Gibco公司；多聚賴氨酸、MTT試劑盒購自美國Sigma公司；免疫共沉淀試劑盒購自美國Invitrogen公司；蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)試劑盒、線粒體抽提試劑盒購自美國Pierce公司；抗Bax抗體購自美國M illipore公司；抗Cyt、抗tublin抗體購自美國BD Bioscience公司；抗HSP60抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 原代神經(jīng)元的培養(yǎng) 出生24 h內(nèi)新生鼠置于超凈臺(tái)，用75%酒精消毒皮膚后，斷頭取腦，放入冰預(yù)冷的D-Hanks液中。仔細(xì)去除腦膜和血管，分離的皮質(zhì)收集于裝有DMEM高糖培養(yǎng)液的離心管中，用巴氏滴管吹打至細(xì)胞分散。制成的細(xì)胞懸液于4℃1 000 rpm離心5min，棄上清，沉淀重懸于神經(jīng)元種植液（DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清），顯微鏡下調(diào)整細(xì)胞密度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，以1×105/L的密度種植于L-多聚賴氨酸（0.1mg/m L）包被的相應(yīng)培養(yǎng)容器中，放入95%O2/5%CO2混合氣體的37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。次日將培養(yǎng)液更換為神經(jīng)元培養(yǎng)液（neurobasalA+2%B27+0.5mmol/L谷氨酰胺+1%青霉素和鏈霉素），之后每隔3～4 d換半液，取培養(yǎng)第10天的神經(jīng)元進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 OGD模型的制備 取原代培養(yǎng)至第10天的神經(jīng)元，傾盡培養(yǎng)液，更換為預(yù)先用 5%CO2、10%H2和 85%N2飽和的DMEM無糖培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)，通入 5%CO2、10%H2和 85%N2，使箱內(nèi)氧濃度＜1%。培養(yǎng)90min后將培養(yǎng)液更換為神經(jīng)元培養(yǎng)液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。

1.2.3 細(xì)胞存活率的測(cè)定 種植于96孔培養(yǎng)板的神經(jīng)元隨機(jī)分為OGD-組和OGD+組。2組神經(jīng)元分別在正常培養(yǎng)后的 第 9 天 加 入 不 同 濃 度（0、5、10、20μmol/L）的 Mdivi-1干預(yù)，第 10天OGD組置缺氧箱90min，再復(fù)氧4 h。取出各組神經(jīng)元，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL 0.5mg/m L的MTT溶液，于37℃溫箱顯色4 h，棄上清，加入DMSO充分溶解紫藍(lán)色結(jié)晶。以DMSO為空白，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)量各孔吸光度（A）值。按照公式計(jì)算神經(jīng)元存活率：神經(jīng)元存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/正常對(duì)照組A值×100%。

1.2.4 免疫共沉淀測(cè)定活性Bax將神經(jīng)元以5×105個(gè)/cm2的密度種植于培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)后的第9天給予Mdivi-1處理，第10天OGD+組置缺氧箱90min，再復(fù)氧4 h。各干預(yù)組常規(guī)收集細(xì)胞，PBS清洗2次，PMSF裂解液加 1×protease inhibitor cocktail setⅠ裂解細(xì)胞，Bradford法蛋白質(zhì)定量，用PBS將總蛋白稀釋到約1 g/L，加入 1μg抗 Bax（NT）抗體到 500μL總蛋白中，室溫下緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物2 h后，加入100μL蛋白A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物。室溫緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物1 h后，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的裂解液洗3遍，將上樣樣品煮5m in，以游離抗原、抗體、珠子，離心，將上清按照Western blot的技術(shù)介紹進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，最后加入抗活性Bax抗體進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 細(xì)胞堿處理測(cè)定Bax的嵌入 神經(jīng)元以5×105個(gè)/cm2的密度種植于培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)后的第9天給予Mdivi-1處理，第10天OGD+組置缺氧箱90min，再復(fù)氧4 h。分別收集各組細(xì)胞，采用0.05%洋地黃皂苷干預(yù)細(xì)胞，使其釋放細(xì)胞漿蛋白，其余細(xì)胞組分在PBD洗滌后，加入0.1mol/LNa2CO3在pH值11.5的堿性環(huán)境下干預(yù)30min。在100 000 g下超速離心1 h，收集沉淀，按照Western blot的技術(shù)介紹進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，最后加入抗Bax抗體進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 CytC釋放的測(cè)定 神經(jīng)元以5×105個(gè)/cm2的密度種植于培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)后的第9天給予Mdivi-1處理，第10天OGD+組置缺氧箱90min，再復(fù)氧4 h。分別收集各組細(xì)胞，采用線粒體抽提試劑盒抽提線粒體。上清液100 000 g超速離心1 h后，再次提取上清液作為細(xì)胞漿蛋白Bradford法蛋白質(zhì)定量。取適量蛋白質(zhì)，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中電泳分離（BIO-RAD電泳及轉(zhuǎn)膜裝置）2 h，電轉(zhuǎn)膜（100 V，1 h）至硝酸纖維素膜，印跡膜在含有5%封閉蛋白的TBS-T緩沖液中封閉1 h，在CytC tublin或HSP60的一抗溶液（抗體用5%封閉蛋白的TBS-T緩沖液1∶1 000稀釋）中4℃孵育過夜，次日加入二抗，ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，組間比較采用one-way ANOVA，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mdivi-1可有效減少OGD所導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡

MTT結(jié)果表明，OGD可顯著降低神經(jīng)元的存活率，應(yīng)用線粒體分裂蛋白Drp1抑制劑Mdivi-1可增加OGD后神經(jīng)元的存活率，與OGD+組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。并且，Mdivi-1在抑制OGD所導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡方面，具有劑量依賴性，10μmol/L是其最佳干預(yù)劑量，見圖1。

2.2 Mdivi-1可有效抑制OGD后細(xì)胞凋亡蛋白Bax的活化和嵌入

圖1 Mdivi-1對(duì)OGD后神經(jīng)元細(xì)胞存活率的影響

通過免疫共沉淀技術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡蛋白Bax的活化提示，在正常培養(yǎng)狀態(tài)下，神經(jīng)元內(nèi)活化的Bax含量極低，難以檢測(cè)。在OGD干預(yù)后，活化Bax的含量顯著增加；Mdivi-1干預(yù)可明顯抑制OGD后細(xì)胞凋亡蛋白的活化，與對(duì)照相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞堿處理可以將疏松附著在線粒體表面的蛋白剝離并洗脫。在超速離心后，所得的線粒體沉淀可檢測(cè)到嵌入線粒體的蛋白，Bax的特異性抗體檢測(cè)嵌入到線粒體的Bax結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)狀態(tài)下，神經(jīng)元內(nèi)嵌入線粒體的Bax含量較低，在OGD干預(yù)后，嵌入線粒體的Bax含量顯著增加；Mdivi-1干預(yù)可明顯減少OGD后細(xì)胞凋亡蛋白Bax的嵌入，與對(duì)照相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，見圖 2。

2.3 Mdivi-1可明顯減少OGD后Cyt C的釋放

Western Blot分別檢測(cè)線粒體和細(xì)胞漿中的CytC含量，結(jié)果顯示，在OGD干預(yù)后，細(xì)胞漿內(nèi)的CytC含量顯著增高，同時(shí)伴隨著線粒體內(nèi)的CytC顯著下降，這意味著Cyt C從線粒體向細(xì)胞漿的釋放增多。Mdivi-1干預(yù)后，細(xì)胞漿內(nèi)的Cyt C含量明顯減少，線粒體內(nèi)的CytC濃度提高，表明Mdivi-1可顯著抑制OGD后CytC的釋放過程，見圖3。

3 討論

線粒體分裂蛋白Drp1主要分布于細(xì)胞漿內(nèi)，在細(xì)胞受到某些損傷性刺激后，Drp1可由細(xì)胞漿向線粒體外膜發(fā)生細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位，遷移至線粒體外膜的Drp1可與分布與線粒體外膜的線粒體分裂蛋白hFis發(fā)生相互作用，從而誘導(dǎo)線粒體斷裂[3，4]。筆者的前期研究結(jié)果表明，OGD 可顯著誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)線粒體發(fā)生過度斷裂，且這一過程和Drp1由細(xì)胞漿向線粒體轉(zhuǎn)位密切相關(guān)[7]。本研究表明在OGD干預(yù)后，神經(jīng)元內(nèi)確實(shí)存在Drp1由細(xì)胞漿向線粒體的轉(zhuǎn)位過程。既往研究表明，在使用星形孢菌素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，Drp1會(huì)從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位到線粒體成點(diǎn)狀聚集，與Bax共定位于線粒體外膜上，通過siRNA下調(diào)Drp1表達(dá)可以Bax的移位增加而CytC的釋放被抑制[8]。盡管Drp1的表達(dá)下調(diào)能夠抑制線粒體的分裂并部分阻止Cyt C釋放，但Estaquier等[9]的研究卻發(fā)現(xiàn)，Drp1的表達(dá)下調(diào)不能阻止那些可以引起Caspase激活和隨后的細(xì)胞凋亡過程的其它輔助因子，如Omi/HtrA2、腺苷酸激酶2等。還有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用化學(xué)抑制劑Mdivi-1抑制Drp1后，也能夠阻止tBid誘導(dǎo)的依賴于Bax/Bak的Cyt C從線粒體釋放，而此過程不涉及線粒體分裂[6]，暗示Drp1可能的促凋亡作用也許與調(diào)節(jié)線粒體分裂無關(guān)。

圖2 Mdivi-1可以有效抑制OGD后細(xì)胞凋亡蛋白Bax的活化和嵌入

圖3 Mdivi-1可明顯減少OGD后CytC的釋放

細(xì)胞凋亡是正常細(xì)胞分化、有毒物質(zhì)致細(xì)胞損傷后清除中的重要步驟。在心腦疾病、腫瘤及自身免疫疾病等，組織內(nèi)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)存在失衡。近來研究指出，許多引起凋亡的因素可引起B(yǎng)ax和僅有BH3（Bcl-2 homology 3）結(jié)構(gòu)域的 tBid 或Bim等從細(xì)胞漿至線粒體轉(zhuǎn)移定位并有線粒體膜電位的改變和磷酸化，從而發(fā)生細(xì)胞凋亡。Bax平時(shí)存在于細(xì)胞漿，為無活性的單體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)重新分布。在生物或病理因素刺激下，細(xì)胞漿Bax構(gòu)象發(fā)生改變，繼而從細(xì)胞漿向線粒體轉(zhuǎn)位，結(jié)合于線粒體膜時(shí)則為二聚體或多聚體的活性分子。Bax的寡聚化可能同樣是由于其構(gòu)象改變所致，Bax N端和BH3結(jié)構(gòu)域暴露后可促進(jìn)其寡聚體的形成。在線粒體外膜上的Bax形成寡聚體，導(dǎo)致線粒體外膜滲透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔打開，線粒體外膜通透性增高。存在于線粒體間隙的Cyt C等物質(zhì)釋放，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10，11]。

Mdivi-1是一種脂溶性物質(zhì)，有文獻(xiàn)表明其可以迅速滲透入細(xì)胞膜，且可以透過血腦屏障。在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中，Mdivi-1可通過抑制線粒體分裂蛋白Drp1的GTP酶活性，抑制線粒體的過度斷裂功能。在帕金森病模型中，Mdivi-1干預(yù)可顯著減少細(xì)胞死亡，重建多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)線粒體分裂/融合的平衡，并改善線粒體的功能[12]。本研究結(jié)果提示，Mdivi-1可顯著減少OGD所誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，其機(jī)制可能為抑制線粒體分裂蛋白Drp1分裂蛋白的GTP酶活性，繼而干預(yù)Drp1和細(xì)胞凋亡蛋白的Bax的相互作用，從而使Bax從細(xì)胞漿至線粒體的轉(zhuǎn)位和嵌入明顯減少，Bax活化障礙。因此在OGD處理后，采用Mdivi-1干預(yù)，可顯著降低細(xì)胞內(nèi)線粒體外膜的通透性，從而使細(xì)胞凋亡前體蛋白Cyt C的釋放顯著減少。

綜上所述，在OGD后抑制Drp1不僅可改善線粒體的形態(tài)，重建線粒體動(dòng)態(tài)平衡，而且可有效干預(yù)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞凋亡前體蛋白釋放減少。對(duì)Drp1的有效干預(yù)，可能會(huì)成為未來治療缺血性腦血管病的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

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M d ivi-1 M ed iates Apop totic Protein Bax Insertion Activation and Cytoch rom e C Release on

Oxygen and Glucose Dep rived Cortical Neu rons

CUIMei,YANG Qi,DONG Qiang.Department of Neurology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai200040

Objective：To study the effectofmitochondrial fission protein inhibitorMdivi-1 on apoptotic protein Bax activation insertion and cytochrome C release of oxygen and glucose deprived cortical neurons.Methods:Primary cultured cortical neuronswere treated with different doses of Mdivi-1 after oxygen-glucose deprivation procedure.MTT was used to evaluate the cell viability.A fter OGD treatment the neurons were treated with 10μmol/L Mdivi-1,co-immunoprecipitation or alkali treatment were used to determine Bax activation and insertion.Mitochondrial and cytosolic fraction proteins were extracted,Western Blot was used to detect the cytochrome C release.Results:Mdivi-1 significantly improved cellviability in a dose-dependentmanner.Mdivi-1 blocked apoptotic protein Bax insertion and activation and subsequent cytochrome C release induced by OGD.Conclusion:Mitochondrial fission protein inhibitor Mdivi-1 has a neuroprotective effect on neurons after OGD,probablymediated by anti-apoptotic effects.

oxygen glucosedeprivation;neurons;mitochondria;apoptotic protein Bax;cytochrome C

R741;R741.02

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.03.001

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 上海200040

國家自然科學(xué)基金（No.81000487，81171 023）； 上海市科委課題 （No.11QA1400900）

2014-01 -01

董強(qiáng)