胡文濤，閆秋月，方瑜，邱占東，張?zhí)K明

人參皂苷Rg1參與誘導(dǎo)小鼠多潛能干細(xì)胞的研究

胡文濤1，閆秋月2，方瑜1，邱占東1，張?zhí)K明1

目的：觀察人參皂苷Rg1對(duì)鼠胚成纖維細(xì)胞（MEF）向誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（iPSCs）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率的影響。方法：采用經(jīng)典四因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染，在細(xì)胞感染后3 d內(nèi)在MEF培養(yǎng)基里加入人參皂苷Rg1（0、0.3、1、3、10 μg/mL），進(jìn)行iPSCs誘導(dǎo)及鑒定。結(jié)果：人參皂苷Rg1（1 μg/mL）組可明顯提高iPSCs的誘導(dǎo)效率，誘導(dǎo)效率為（0.0450±0.0019）%，人參皂苷Rg1（0 μg/mL）組為（0.0100±0.0033）%，所獲iPSCs經(jīng)鑒定為陽性。結(jié)論：人參皂苷Rg1可能在提高小鼠iPSCs的誘導(dǎo)效率方面發(fā)揮一定作用。

人參皂苷Rg1；誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞；細(xì)胞重編程；鼠胚成纖維細(xì)胞

2006 年Takahashi和Yamanaka將成年大鼠的成纖維細(xì)胞通過轉(zhuǎn)入一組轉(zhuǎn)錄因子將成體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）[1]。iPSCs具備胚胎干細(xì)胞自我更新和多向分化的特性，解決了影響胚胎干細(xì)胞應(yīng)用過程中所存在的倫理學(xué)和免疫原性問題，在疾病模型、藥物篩選、機(jī)制研究方面具有特定的優(yōu)勢，為再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展開辟了新方向。然而誘導(dǎo)效率低和外源基因的引入制約著iPSCs的應(yīng)用，近年來在解決這兩大問題方面已做過較多嘗試，包括減少外源性因子的應(yīng)用[2]、非整合基因方式[3]及蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[4]等，但誘導(dǎo)效率低下一直阻礙iPSCs的研究及應(yīng)用。本研究通過在經(jīng)典的四因子誘導(dǎo)體系中添加人參皂苷Rg1誘導(dǎo)鼠iPSCs，觀察人參皂苷Rg1對(duì)小鼠多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)效率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 孕12.5 d的昆明孕鼠，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 質(zhì)粒 pMXs-IRES-Sox2、pMXs-IRES-c-Myc、pMXs-IRES-Klf4、pMXs-IRESOct4購于美國Addgene公司；Plat-E細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購于美國Hyclone公司；非必需氨基酸、胎牛血清購于美國Gibco公司；L-谷氨酰胺、青/鏈霉素、β-巰基乙醇購于美國Sigma公司；LIF、SSEA-1、Oct4和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）染色試劑購于美國Millipore公司；熒光顯微鏡購于日本Olympus公司；Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司；小提質(zhì)粒提取試劑盒購于美國Omega公司；37℃CO2培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 鼠 胚 成 纖 維 細(xì) 胞 （mouse embryonic fibroblasts，MEF）的獲取 處死昆明孕鼠，用無菌手術(shù)器械剖腹取出胎鼠，PBS沖洗，分離皮膚組織，剪碎后經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化獲得單細(xì)胞懸液，接種于MEF培養(yǎng)基（DMEM/F12培養(yǎng)基、10%胎牛血清和2%青/鏈霉素）中，放于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后進(jìn)行傳代，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 感染病毒顆粒的制備 將質(zhì)粒（pMXs-IRES-Sox2、pMXs-IRES-c-Myc、pMXs-IRESKlf4、pMXs-IRES-Oct4） 分別通過 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞（Plat-E細(xì)胞），48 h后收取逆轉(zhuǎn)錄病毒液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后待用，加入polybrene（終濃度4 μg/mL）。以含綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒作為對(duì)照。

1.2.3 iPSCs的誘導(dǎo) 將第1或2代MEF分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，用無抗培養(yǎng)基（DMEM高糖溶液+10%胎牛血清）按3× 104/孔的密度分別接種到六孔板中，每組接種6個(gè)孔，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)約30%時(shí)每孔中加4種病毒各250 μL進(jìn)行感染，感染12 h后換無抗培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，如此再循環(huán)2次，然后加入胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM高糖溶液、15%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%β-巰基乙醇、1%青/鏈霉素、1‰LIF）培養(yǎng)，感染后第1～3天每孔人參皂苷Rg1分別按0、0.3、1、3、10 μg/mL劑量添加，每天換液觀察直到克隆出現(xiàn)。根據(jù)每孔出現(xiàn)的克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)計(jì)算誘導(dǎo)效率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 iPSCs的鑒定 iPSCs克隆出現(xiàn)后用1 mL注射器挑出后在MEF制成的飼養(yǎng)層上擴(kuò)增，在添加了LIF因子的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中可有效保持其未分化狀態(tài)及增殖能力，為細(xì)胞提供包被有0.1%明膠的培養(yǎng)皿作為粘附細(xì)胞的基質(zhì)，每2～3天按1∶（4～8）的比率傳代細(xì)胞一次。細(xì)胞傳代以后，如有分化的細(xì)胞，可將細(xì)胞接種在0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過將分化細(xì)胞黏附在沒有包被的組織培養(yǎng)板上去除分化細(xì)胞，從而純化iPSCs，傳代后對(duì)其進(jìn)行AP、Oct4及SSEA-1染色鑒定。AP鑒定根據(jù)AP染色試劑盒說明書進(jìn)行，顯微鏡下觀察。免疫熒光Oct4及SSEA-1染色用4%多聚甲醛固定；0.2%TritonX-100破膜10 min；PBS沖洗；羊血清封閉，一抗Oct4或SSEA-1（1∶200稀釋）4℃孵育過夜；加1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的二抗，室溫孵育后DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 病毒顆粒的包裝

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染PLAT-E細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，轉(zhuǎn)染后48 h平行對(duì)照組GFP的轉(zhuǎn)染效率為80%～90%，見圖1。

圖1 PLAT-E細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h光鏡下形態(tài)（A）和熒光顯微鏡下GFP表達(dá)（B）（×100）

2.2 iPSCs的誘導(dǎo)效率及鑒定

感染后第20天觀察到胚胎干樣細(xì)胞克隆。根據(jù)每孔出現(xiàn)的克隆個(gè)數(shù)計(jì)算出細(xì)胞的誘導(dǎo)效率，分別添加人參皂苷Rg1 0、0.3、1、3、10 μg/mL的誘導(dǎo)效率分別為（0.0100±0.0033）%、（0.0280±0.0019）%、（0.0450±0.0019）%、（0.0240±0.0019）%、（0.0160±0.0019）%，見圖2。對(duì)四因子誘導(dǎo)添加人參皂苷Rg1 1 μg/mL獲得的iPSCs進(jìn)行AP、SSEA-1、Oct4染色鑒定均呈陽性，見圖3。

圖2 不同濃度人參皂苷Rg1誘導(dǎo)所得iPSCs克隆數(shù)目

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在小鼠iPSCs誘導(dǎo)過程中添加人參皂苷Rg1，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的iPSCs誘導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，提高了誘導(dǎo)效率。Chen等[5]發(fā)現(xiàn)Rapamycin等抗衰老藥物可以提高小鼠細(xì)胞重編程的效率，在小鼠細(xì)胞重編程的早期給予Rapamycin或mTOR信號(hào)通路的抑制劑pp242處理都能顯著提高重編程的效率。同時(shí)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，包括Sirtuin蛋白的激動(dòng)劑Resveratrol，以及 Autophagy的激活劑Spermidine在內(nèi)的多種抗衰老藥物都可有效提高細(xì)胞重編程的效率。人參皂苷Rg1是人參活性成分中已提純的單體成分，也是抗衰老藥物的一種，具有Ca2+拮抗作用、抗衰老作用，改善學(xué)習(xí)記憶技能，促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成作用，對(duì)中樞神經(jīng)有興奮作用[6]。已有研究表明人參皂苷Rg1能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá) c-Myc、Nanog， 且 Oct4、Klf4、Sox2 mRNA表達(dá)均有升高，Nanog陽性的iPSCs在基因表達(dá)譜上很難與胚胎干細(xì)胞區(qū)分出來[7]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)Rg1能夠抑制由TGF-beta1帶來的NRK-52k細(xì)胞的形態(tài)改變，抑制α-SMA的表達(dá)和增加E-cadherin的表達(dá),同時(shí)抑制P-ERK1/2的表達(dá)[8]。E-cadherin的表達(dá)增加和P-ERK1/2的表達(dá)減少均可以加速間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)變，從而提高重編程效率[9]。此外，人參皂苷Rg1通過β-catenin核內(nèi)聚集激活WNT/β-catenin信號(hào)途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化[10]，而研究表明在培養(yǎng)液中添加Wnt3a，可激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路，提高4因子和3因子的重編程效率，并可部分補(bǔ)償c-myc的缺失[11]。本研究通過感染后分別以4種濃度添加人參皂苷Rg1，觀察到1 μg/mL可明顯提高iPSCs的誘導(dǎo)效率，但人參皂苷Rg1在誘導(dǎo)過程中的最佳濃度及機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究首次將人參皂苷Rg1引入iPSCs誘導(dǎo)體系，提高了iPSCs的誘導(dǎo)效率，豐富了細(xì)胞重編程的發(fā)生機(jī)制，為iPSCs的研究及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖3 實(shí)驗(yàn)組MEF感染前形態(tài)（A）和iPSCs形態(tài)（B），iPSCs的AP染色（C）（×100），iPSCs的Oct-4免疫熒光（×200）（D），D中細(xì)胞核DAPI染色（E），iPSCs的SSEA-1免疫熒光（×200）（F），F(xiàn)中細(xì)胞核DAPI染色（G）

[1]Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J]. Cell,2006,126:663-676.

[2]Kim JB,Sebastiano V,Wu G,et al.Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells[J]. Cell,2009,136:411-419.

[3]Gonzalez F,Barragan Monasterio M,Tiscornia G,et al.Generation of mouse-induced pluripotent stem cells by transient expression of a single nonviral polycistronic vector[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106:8918-8922.

[4]Kim D,Kim CH,Moon JI,et al.Generation ofhuman induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins[J]. Cell Stem Cell,2009,4:472-476.

[5]Chen T,Shen L,Yu J,et al.Rapamycin and other longevity-promoting compounds enhance the generation of mouse induced pluripotent stem cells[J].Aging Cell,2011,10:908-911.

[6]Bahrke MS,Morgan WR.Evaluation of the ergogenic properties of ginseng:an update[J]. Sports Med,2000,29:113-133.

[7]李佳瑋,張密霞,周濤,等.人參皂苷Rg1干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多潛能干細(xì)胞關(guān)鍵基因mRNA的表達(dá)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15:6032-6035.

[8]Xie XS,Yang M,Liu HC,et al.Ginsenoside Rg1,a major active component isolated from Panax notoginseng,restrains tubular epithelial to myofibroblast transition in vitro[J].J Ethnopharmacol,2009,122:35-41.

[9]Lu X,Law BK,Chytil AM,et al.Activation of the Erk pathway is required for TGF-beta 1-induced EMT in vitro [J].Neoplasia,2004,6: 603-610.

[10]Tang T,Zhang G,Guo B,et al.Ginsenoside-Rg1,as an activator of WNT/β-catenin signaling,promotes human osteoblastic differentiation in vitro[J].Bone,2010,47:S385-S458.

[11]Marson A,Foreman R,Chevalier B,et al. Wnt signal promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency cell[J].Stem cell,2008,3: 132-135.

Roles of Ginsenoside Rg1 in the Induction of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells

Objective:To observe the effects of Ginsenoside Rg1 on the induce efficiency of mouse induced pluripotent stem cells(iPSCs)from Mouse embryonic fibroblasts(MEF).Methods:The cells were infected with classic retro-viruses vector expressing classic 4 factors,then Ginsenoside Rg1 (0、0.3、1、3、10 μg/mL)was added to the MEF medium during the first 3 days after infection.Then the clones were identified.Results:Ginsenoside Rg1（1 μg/mL）can obviously improve the induction efficiency of iPSCs[(0.0450±0.0019)%in the Ginsenoside Rg1group vs(0.0100±0.0033)%in the control group)].The clones were positive.Conclusion:Ginsenoside Rg1 may facilitate the inducing efficiency of iPS cells.

Ginsenoside Rg1;induced pluripotent stem cells;cellular reprogramming;mouse embryonic fibroblasts

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.004

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢430030 2.滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科河北 滄州061000

國家自然科學(xué)基金（No.81271407）中國博士后科學(xué)基金（No.20110490453)

2013-10-14

張?zhí)K明suming_zhang@163. com