方瑜，邱占東，閔哲，熊永潔，胡文濤，黃梁江，張?zhí)K明

激光散斑成像監(jiān)測C57小鼠皮質(zhì)血流及光化學(xué)缺血變化

方瑜，邱占東，閔哲，熊永潔，胡文濤，黃梁江，張?zhí)K明

目的：探索激光散斑成像（LSI）技術(shù)在監(jiān)測C57BL/6小鼠腦皮質(zhì)血流中的應(yīng)用，初步觀察光化學(xué)腦梗死模型的腦皮質(zhì)血流改變。方法：采用8只8～10周雄性C57BL/6小鼠，麻醉后切開頭皮置于LSI系統(tǒng)下觀察腦皮質(zhì)血流變化。5只8～10周雄性C57BL/6小鼠制作光化學(xué)梗死灶模型，分別在光化學(xué)造模前及造模后24 h觀察腦皮質(zhì)血流變化，同時5只8～10周雄性C57BL/6小鼠假手術(shù)作為假手術(shù)組。結(jié)果：8只C57小鼠可以在不損傷顱骨的條件下實(shí)現(xiàn)較長時間的腦血流成像檢查，具有較高成像質(zhì)量，可以辨別腦皮質(zhì)小血管血流變化。5只小鼠光化學(xué)造模取得成功，利用LSI可以觀察到24 h后腦皮質(zhì)梗死區(qū)血流量變化，部分小血管血流減少或消失。尼氏染色顯示手術(shù)組小鼠皮質(zhì)腦梗死形成。結(jié)論：LSI可以觀察C57小鼠腦皮質(zhì)血流變化，具有較高的空間及時間分辨率。

激光散斑成像；腦梗死；腦血流

目前全世界腦血管病的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，疾病的預(yù)防與治療面臨重大挑戰(zhàn)[1]。腦血管病變直接導(dǎo)致腦血流改變，造成腦供血供氧不足，帶來繼發(fā)性損害，因此對腦血流（cerebral blood flow，CBF）的基礎(chǔ)研究具有非常重要的臨床價值。在動物實(shí)驗(yàn)研究中，常用的活體血流量研究方法有超聲多普勒[2]、激光多普勒成像[3]、磁共振灌注成像[4]及熒光成像[5]等，但這幾種技術(shù)各有不足，如需注入熒光劑，對顱骨進(jìn)行特殊處理等，往往限制了應(yīng)用。

激光散斑成像（laser speckle imaging， LSI）是近年來興起的一種技術(shù)，其基于激光的“散斑”現(xiàn)象，通過計算機(jī)處理后形成二維圖像動態(tài)顯示血流變化，目前已運(yùn)用于皮膚血管瘤等表淺血管性病變的檢查[6]。在神經(jīng)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究中該技術(shù)多用于大鼠大腦中動脈閉塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的血流觀察。LSI在具體運(yùn)用中也存在技術(shù)問題：在實(shí)驗(yàn)中為了取得較好的成像效果需對大鼠顱骨進(jìn)行磨薄處理，這就提高了實(shí)驗(yàn)難度，增加了動物的損傷，同時由于受損顱骨的炎性反應(yīng)不利于重復(fù)檢查。本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)由于C57BL/6小鼠顱骨較薄，對檢查的激光有較高的透過率，因此本實(shí)驗(yàn)嘗試在保持小鼠顱骨完整情況下進(jìn)行LSI，同時初步檢驗(yàn)其對小鼠光化學(xué)腦梗死模型的成像效果，探索LSI與點(diǎn)狀光化學(xué)腦梗死模型結(jié)合的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 8～10周雄性C57BL/6小鼠18只，體質(zhì)量為18～24 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 主要試劑與材料 玫瑰紅（rose bengal，購于美國Sigma公司），生理鹽水（購于湖北雙鶴公司），水合氯醛（購于武漢合昌化工公司），醫(yī)用酒精、簡易小鼠固定器、小鼠負(fù)反饋加熱墊（購于深圳瑞沃德公司），LSI系統(tǒng)（由華中科技大學(xué)國家光電實(shí)驗(yàn)室提供）[7]，SZ61體視顯微鏡（購于日本Olympus公司），PixelFly VGA CCD（12 bit）相機(jī)（購于德國PCO公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腦皮質(zhì)血流成像 8只小鼠觀察腦皮質(zhì)的血流狀況，實(shí)驗(yàn)過程遵從華中科技大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理道德準(zhǔn)則。小鼠5%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔麻醉后，俯臥位固定于小鼠固定器，酒精消毒后采用縱向切口切開頭皮（1.5～1.8 cm），充分暴露顱骨，分離骨膜，利用生理鹽水保持顱骨濕潤，同時用棉簽及微創(chuàng)小鑷子將顱骨表面細(xì)小雜質(zhì)清理干凈。隨后連同小鼠固定器置于LSI系統(tǒng)下觀察CBF圖像，參數(shù)設(shè)定參照下文LSI系統(tǒng)設(shè)置部分。首先觀察小鼠腦皮質(zhì)全景成像，記錄時間為30 min，分析采用興趣區(qū)域的血流變化，興趣區(qū)域?yàn)橛覀?cè)大腦中動脈供血區(qū)域，矩形面積為（2×3）mm2，記錄完畢后提取5、10、30 min的興趣區(qū)域的CBF數(shù)值。顯微鏡下觀察小鼠桶裝皮質(zhì)血流，分析成像效果及質(zhì)量。在整個手術(shù)過程中需監(jiān)測肛溫，且通過負(fù)反饋控制加熱毯保持小鼠體溫恒定在（37.0±0.2）℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，注射過量麻醉劑對小鼠實(shí)施安樂死。

1.2.2 LSI系統(tǒng)觀察小鼠腦皮質(zhì)點(diǎn)狀光化學(xué)缺血灶 10只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和手術(shù)組各5只。制備光化學(xué)腦梗死模型：麻醉和前期準(zhǔn)備如前所述，在對小鼠腦皮質(zhì)血流拍照后，小鼠位置不動，腹腔注射玫瑰紅溶液（100 mg/kg），注射5 min后利用100 mv、532 nm二極管激光以與水平成60°角對小鼠桶狀皮質(zhì)區(qū)照射2 min（光斑直徑為2 mm），然后縫合頭皮。假手術(shù)組不采用二極管激光照射。24 h后采用上述方式對小鼠麻醉后，設(shè)置同樣圖像參數(shù)再次觀察腦皮質(zhì)血流。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，生理鹽水心臟灌流后取腦置于4%多聚甲醛固定，備做病理檢查。

1.2.3 LSI顱骨的激光照射光源為660 nm的二極管激光器，曝光時間5 ms，以45°均勻照射小鼠顱骨，反射光由體視顯微鏡上的CCD相機(jī)采集（分辨率為640×480像素）。數(shù)據(jù)分析通過計算機(jī)算法將血流速度信息轉(zhuǎn)換為二維血流圖，局部圖像由其自帶圖像軟件反色處理。

1.2.4 標(biāo)本病理學(xué)檢查 采用尼氏染色區(qū)分腦梗死組織，光化學(xué)造模實(shí)驗(yàn)中多聚甲醛固定后的小鼠大腦通過梯度沉糖后，冰凍切片（片厚7 μm），貼片晾干后，置于無水酒精中1 min；95%酒精、70%酒精各1 min，蒸餾水洗片刻；浸入0.1%焦油紫染液37℃溫箱中染色5 min，蒸餾水洗滌；95%酒精分色；常規(guī)脫水、透明、封片觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

CCD相機(jī)數(shù)據(jù)處理后可獲取血管的白光圖像和激光散斑圖像。興趣區(qū)域激光散斑圖像的數(shù)值為區(qū)域內(nèi)平均CBF值（mean CBF，mCBF），檢測過程中5、10、30 min的相對血流值（relative CBF，rCBF）為相應(yīng)時刻的mCBF值除以0 min時的mCBF值計算而得。采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠腦皮質(zhì)血流成像結(jié)果

8只小鼠均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，獲得小鼠腦皮質(zhì)血流圖，通過調(diào)節(jié)可顯示腦皮質(zhì)內(nèi)血管血流，反映了血管形態(tài)，見圖1A-C。對多個興趣點(diǎn)rCBF比較分析后顯示興趣區(qū)域內(nèi)的血流流速穩(wěn)定，在5、10、30 min時血流相對速度穩(wěn)定，其分別為0 min基線值的（0.99±0.04）、（0.98±0.02）、（0.99±0.03），無統(tǒng)計學(xué)差異。通過調(diào)節(jié)體視顯微鏡，在不同的放大倍數(shù)觀察血管血流形態(tài)，可清晰顯示最小內(nèi)徑為30～50 μm的皮質(zhì)內(nèi)小血管的血流信息，見圖1D-F。

圖1 C57小鼠的腦皮質(zhì)血流

2.2 小鼠腦皮質(zhì)點(diǎn)狀光化學(xué)缺血灶觀察

光化學(xué)腦梗死造模實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組小鼠腦皮質(zhì)血流24 h后觀察未發(fā)現(xiàn)明顯的血流量減少，見圖2A-B；局部小血管血流未見明顯變化，見圖2C-D。手術(shù)組小鼠成功進(jìn)行光化學(xué)腦梗死造模，注入玫瑰紅照射后24 h可觀察到明顯的缺血灶，與照射前相比較，腦皮質(zhì)局部血流灌注量減低，在小鼠桶狀皮質(zhì)區(qū)域可形成大小約2 mm的梗死灶，與激光直徑大小類似，周邊可見腦血流信號降低，為缺血的腦組織，見圖2E-F。同時梗死區(qū)域小血管血流消失，周圍小血管血流也不同程度減少，見圖2G-H。

圖2 LSI觀察點(diǎn)狀光化學(xué)缺血灶

2.3 病理改變

常規(guī)尼氏染色假手術(shù)組大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及分布未見異常，神經(jīng)細(xì)胞輪廓清晰，形態(tài)完整，數(shù)量較多，排列整齊，見圖3A-B。手術(shù)組24 h后低倍光鏡下可見腦皮質(zhì)內(nèi)梗死區(qū)域，組織疏松，可顯示與正常腦組織的邊界，高倍光鏡顯示神經(jīng)細(xì)胞間質(zhì)水腫，神經(jīng)細(xì)胞核固縮、濃染，細(xì)胞數(shù)量減少，排列不規(guī)則，見圖3C-D。

圖3 光化學(xué)激光照射的皮質(zhì)區(qū)尼氏染色

3 討論

LSI在動物活體腦血流的測量技術(shù)中較傳統(tǒng)的方法有很多優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)快速二維成像，且不需要加用熒光劑，同時價格相對低廉，具有一定的優(yōu)勢。激光散斑是一種光學(xué)干涉現(xiàn)象，當(dāng)相干光從粗糙表面反射或通過折射率無規(guī)漲落的媒介時，會形成隨機(jī)分布的散斑圖樣。當(dāng)一種媒質(zhì)里有流動的微小顆粒（如血管中流動的血細(xì)胞），反射光也會呈現(xiàn)“散斑”現(xiàn)象[6]。介質(zhì)流動的速度會影響到其散斑的亮度值和亮度值的分布特征，因而可以得到區(qū)分運(yùn)動與靜止介質(zhì)的特征。自上世紀(jì)60年代建立散斑理論基礎(chǔ)，90年代開始運(yùn)用于血流的檢測[6]。在生物醫(yī)學(xué)方面，LSI已經(jīng)被用來研究皮膚[8]、視網(wǎng)膜[9]等組織的血流變化及大鼠胡須刺激的感覺功能成像[10]等。在神經(jīng)血流成像目前有研究在行外科手術(shù)時觀察腦表面血流變化[11]，在動物實(shí)驗(yàn)中多運(yùn)用于大鼠MCAO模型后的側(cè)支循環(huán)及血流量變化的研究[12]。本課題組發(fā)現(xiàn)C57小鼠顱骨較薄且較小，在目前的光鏡下基本上可以實(shí)現(xiàn)全腦皮質(zhì)血流成像。C57小鼠作為多種轉(zhuǎn)基因小鼠的背景種系，觀察其血流變化具有更廣闊的研究空間。本實(shí)驗(yàn)中在不同時間點(diǎn)觀察興趣點(diǎn)的rCBF值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在30 min內(nèi)小鼠的血流量基本穩(wěn)定，這說明該方法可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的動態(tài)成像。在LSI中腦血流反映血管形態(tài)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對小血管的顯示最小可達(dá)30～ 50 μm，這也為小鼠腦皮質(zhì)小血管功能研究提供了良好的研究工具。

光化學(xué)腦梗死模型是目前常運(yùn)用的腦梗死模型中的一種，其基本原理在于光敏劑在激發(fā)光下產(chǎn)生大量的活性氧自由基，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而血小板凝集產(chǎn)生梗死灶，與MCAO模型相比具有低死亡率和制作簡單的特點(diǎn)[13]。本研究探索了光化學(xué)腦梗死灶造模結(jié)合LSI系統(tǒng)觀察梗死灶的血流灌注變化，24 h后觀察到明顯梗死灶，周邊組織表現(xiàn)為缺血狀態(tài)。局部可以清楚觀察梗死灶周圍的小血管血流信息，與梗死前相比較可發(fā)現(xiàn)小血管血流減少甚至消失；同時病理學(xué)結(jié)果顯示腦組織間質(zhì)水腫、神經(jīng)細(xì)胞皺縮濃染，表明該區(qū)域的梗死形成。LSI的偽彩圖像可以直觀地顯示梗死區(qū)域、缺血區(qū)域及正常組織的血流特點(diǎn)。由于該模型損傷較小，小鼠模型的死亡率低，縫合后可以再次切開頭皮觀察缺血灶，實(shí)現(xiàn)重復(fù)檢查，可進(jìn)行較長時間的藥物對照研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明利用LSI可在不損傷顱骨的情況下對C57小鼠進(jìn)行腦皮質(zhì)血流的檢查，獲得理想的二維血流圖，對細(xì)小血流顯示清晰，為腦血流的研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。同時LSI成功檢測到光化學(xué)造模后局部血流降低，這表明結(jié)合LSI，對模型進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化可能為將來腦梗死研究提供很好的研究平臺。

[1]Strong K,Mathers C,Bonita R.Preventing stroke: saving lives around the world[J].Lancet Neurol,2007, 6:182-187.

[2]Jeffrey-Gauthier R,Guillemot JP,Piché M.Neurovascular coupling during nociceptive processing in the primary somatosensory cortex of the rat[J].Pain, 2013,154:1434-1441.

[3]Tsai MJ,Tsai YH,Kuo YM.Characterization of the pattern of ischemic stroke induced by artificial particle embolization in the rat brain[J].Biomaterials, 2011,32:6381-6388.

[4]Hayward NM,Tuunanen PI,Immonen R,et al. Magnetic resonance imaging of regional hemodynamic and cerebrovascularrecovery after lateral fluid-percussion brain injury in rats[J].J Cereb Blood Flow Metab,2011,31:166-177.

[5]Guo H,Itoh Y,Toriumi H,et al.Capillary remodeling and collateral growth without angiogenesis after unilateral common carotid artery occlusion in mice[J].Microcirculation,2011,18:221-227.

[6]Boas DA,Dunn AK.Laser speckle contrast imaging in biomedical optics[J].J Biomed Opt,2010, 15:011109.

[7]Wang Z,Luo W,Zhou F,et al.Dynamic change of collateral flow varying with distribution of regional blood flow in acute ischemic rat cortex[J].J Biomed Opt,2012,17:125001.

[8]Huang YC,Ringold TL,Nelson JS,et al.Noninvasive blood flow imaging for real-time feedback during laser therapy of port wine stain birthmarks[J]. Lasers Surg Med,2008,40:167-173.

[9]Zhang W,Kogure A,Yamamoto K,et al.Use of the laser speckle flowgraphy in posterior fundus circulation research[J].Chin Med J (Engl),2011,124: 4339-4434.

[10]Masino SA,Frostig RD.Quantitative long-term imaging of the functional representation of a whisker in rat barrel cortex[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 1996,93:4942-4947.

[11]Dunn AK.Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow[J].Ann Biomed Eng,2012,40: 367-377.

[12]李昌盛,閔喆,湛彥強(qiáng),等.利用激光散斑成像技術(shù)觀察尤瑞克林對腦梗死大鼠腦血流的影響 [J].中華神經(jīng)科雜志,2010,43:732-736.

[13]Choi BI,Park D,Lee SH,et al.Neurobehavioural deficits correlate with the cerebral infarction volume of stroke animals: a comparative study on ischaemia-reperfusion and photothrombosis models[J]. Environ Toxicol Pharmacol,2012,33:60-69.

Laser Speckle Imaging of Mice Cerebral Blood Flow and Cortical Infarction

Objective:To explore the application of laser speckle imaging in monitoring C57BL/6 mice cerebral blood flow under normal condition and the photochemical infarction.Methods:Eight 8～10 weeks male C57BL/6 mice were used for blood flow detection.The cortex blood flow of the C57BL/6 mice was monitored by laser speckle imaging system for 30 minutes.Five 8～10 weeks male C57BL/6 mice were induced cortical photochemical infarct while five 8～10 weeks male C57BL/6 mice in sham group received sham operation.Laser speckle imaging was preformed before and 24 hs after the surgery.Results:Eight C57 mice can be detected cerebral blood flow imaging with high image quality without damaging the skull.The small blood vessels can be observed by this system.In the photothrombosis group,small blood flow was decreased or disappeared on the cortex of mice using laser speckle image.Conclusion:The image of C57 mice brain cortical blood flow could be obtained by laser speckle imaging with high spatial and temporal resolution.

laser speckle imaging;ischemic stroke;cerebral blood flow

R741;R741.04

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.01.004

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢430030

武漢市科技計劃項(xiàng)目（No.2013060501010 159）

2013-10-07

張?zhí)K明Suming_zhang@163. com