付溪，高洪杰，婁麗萍，高金枝，張文迪，羅小平

慢病毒介導(dǎo)的shRNA對大鼠腦紋狀體GCDH蛋白的沉默效應(yīng)研究

付溪a，高洪杰a，婁麗萍b，高金枝a，張文迪a，羅小平a

目的：利用已成功構(gòu)建的慢病毒載體，檢測慢病毒介導(dǎo)的GCDH基因沉默對大鼠腦紋狀體GCDH蛋白表達(dá)下調(diào)的能力。方法：30只健康雄性剛斷乳3～4周SD大鼠隨機(jī)分為綠色熒光蛋白（GFP）對照病毒注射組（對照組）和GCDH慢病毒注射組（GCDH組）各15只。各組分別在腦立體定位儀下定位紋狀體組織后單側(cè)給予GFP對照病毒2 μL和GCDH慢病毒原液2 μL。注射后14 d及1、3月，分別處死大鼠，并取注射區(qū)域的腦紋狀體組織蛋白質(zhì)通過Western blot及石蠟切片免疫組化法檢測大鼠紋狀體GCDH蛋白表達(dá)水平，同時(shí)測定肝腎功能、血清有機(jī)酸及Rotarod行為學(xué)。結(jié)果：GCDH慢病毒注射14 d及1、3月后，GCDH組可檢測到注射區(qū)域GCDH蛋白在腦紋狀體區(qū)域表達(dá)有明顯降低，同對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)，2組肝腎功能、血清有機(jī)酸及行為學(xué)未發(fā)現(xiàn)明顯差異。結(jié)論：成功注射GCDH慢病毒到剛斷乳3～4周SD大鼠腦紋狀體，并在注射后不同時(shí)間均檢測到GCDH蛋白的表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)。

GCDH；慢病毒載體；腦立體定位注射；紋狀體

戊二酸尿癥Ⅰ型是因?yàn)槲於］o酶A脫 氫 酶 （glutaryl-CoA dehydrogenase，GCDH）基因缺陷引起賴氨酸﹑羥賴氨酸及色氨酸代謝受阻導(dǎo)致異常代謝產(chǎn)物在體液中蓄積的常染色體隱形遺傳病，1975年由Goodman等[1]首次報(bào)道。目前已有多項(xiàng)研究建立多種該疾病的細(xì)胞和動(dòng)物模型[2]。同時(shí)，在既往研究中，慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)或沉默時(shí)間可長達(dá)6個(gè)月，適用于建立長期而穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因載體疾病模型或基因治療模型[3]。在這個(gè)理論的基礎(chǔ)上，筆者實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建靶向沉默大鼠GCDH基因的慢病毒載體，成功轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)紋狀體神經(jīng)元[4]，從而利用慢病毒介導(dǎo)的GCDH基因沉默和高濃度賴氨酸飼養(yǎng)成功構(gòu)建新的戊二酸尿癥Ⅰ型研究體外模型。同時(shí)，得出GCDH基因沉默和高濃度賴氨酸飼養(yǎng)致紋狀體神經(jīng)元活性降低，凋亡增加。而筆者還未驗(yàn)證該慢病毒載體在動(dòng)物體內(nèi)水平的轉(zhuǎn)染效率與病理作用。因此本研究在剛斷乳的SD大鼠腦紋狀體局部注射GCDH慢病毒載體靶向沉默GCDH基因，觀察體內(nèi)慢病毒沉默GCDH蛋白水平和穩(wěn)定表達(dá)時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級SD大鼠30只，剛斷乳，3～4周齡，體質(zhì)量50～80 g，由華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。每籠2～3只飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，每日補(bǔ)充飼料及高壓滅菌水。

1.1.2 主要試劑與材料 高滴度的綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）慢病毒顆粒（2×109TU/mL）及高滴度GCDH沉默慢病毒顆粒（2×109TU/mL）（購于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）；兩步法免疫組化檢測試劑盒（購于丹麥DACO公司）；BCA蛋白測定試劑盒（購于上海碧云天公司）；封閉用山羊血清原液（購于北京中杉生物工程有限公司）；兔抗GCDH抗體，鼠抗β-actin（購于美國Santa Cruz公司）；微量注射器（購于美國Hamilton公司）；冰凍切片機(jī)，顯微切割儀LMD 6500（購于德國LEICA公司）；IPP圖像分析系統(tǒng)（購于美國MC公司）；腦立體定位儀（購于美國Stoelting公司）；熒光顯微鏡顯微照相系統(tǒng)（購于日本Olympus公司）；羅氏DPPI全自動(dòng)生化分析儀（購于美國Roche公司）；島津GC-MS QP2010Ultra氣象色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（購于日本島津公司）；Rotarod Test測試儀（購于意大利Ugo Basile公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 大鼠隨機(jī)分為GFP對照病毒注射組（對照組）和GCDH慢病毒注射組（GCDH組）各15只。分別在各組大鼠腦紋狀體內(nèi)單側(cè)注射慢病毒顆粒2 μL。注射后14 d和1、3月分別處死大鼠，行全腦冰凍切片及石蠟切片，并提取注射部位的紋狀體組織。

1.2.2 腦立體定位微量注射 水合氯醛0.5～1 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠。碘伏消毒，剪毛，剪去表層皮膚，30%H2O2擦拭暴露顱骨，在腦立體定向儀上根據(jù)外耳道、牙齒、冠狀縫、矢狀縫、前囟位置固定大鼠；參照Paxinos[5]大鼠腦立體定位圖譜及多次注射摸索的位點(diǎn)，確立紋狀體坐標(biāo)為：前囟前0～0.5 mm，中線側(cè)旁開2.5～3 mm，硬膜下5～6 mm。調(diào)整游標(biāo)卡尺對應(yīng)其坐標(biāo)點(diǎn)，用牙科鉆孔器鉆孔，用5 μL微量注射器進(jìn)針，緩慢注射，注射速度0.3 μL/min，注射完畢停留15 min，按1 mm/min速度緩慢退針。碘伏消毒，縫皮，置于動(dòng)物手術(shù)復(fù)蘇室等待蘇醒。注射結(jié)束后觀察動(dòng)物的死亡率及反應(yīng)。選取無感染、無硬腦膜出血的大鼠進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 取材及切片 分別在注射后的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取腦組織，其中動(dòng)物體質(zhì)量以3次測量均數(shù)為當(dāng)日體質(zhì)量。3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，用鋒利剪刀沿大鼠頭皮正中剪開頭皮，露出顱骨，小心分離顱骨和腦膜后，取出大腦組織快速置入液氮中迅速降溫，隨后快速冰凍切片后直接在熒光顯微鏡下觀察紋狀體熒光分布，隨后根據(jù)冰凍切片顯示的綠色熒光分布，將其送至我院病理科進(jìn)行顯微切割，將帶有綠色熒光的紋狀體組織切割下移至EP管中，－80℃保存。其它大鼠需先用4%多聚甲醛固定。首先準(zhǔn)備灌注臺(tái)，生理鹽水1 000 mL和4%多聚甲醛1 000 mL 4℃預(yù)冷。3%戊巴比妥鈉麻醉各組大鼠后，依次打開胸腔，小心快速分離，防止出血，徹底暴露心臟，用眼科剪剪破右心耳，用頭皮針尖刺入左心室直至穿透主動(dòng)脈，首先用200 mL生理鹽水灌注，直至無血液流出后換250 mL的4%多聚甲醛灌注。灌注多聚甲醛同時(shí)觀察鼠身體僵硬及鼠尾巴硬度變化，待鼠尾巴和鼠身體完全僵硬后，開始迅速取材。取出的大腦組織快速置入4℃預(yù)冷4%多聚甲醛再固定24 h，然后依次用15%和30%的蔗糖梯度脫水直至腦沉入容器底部，用冰凍切片機(jī)進(jìn)行紋狀體慢病毒注射區(qū)域的冠狀腦片切片，切片厚度為10 μm，貼于防脫的玻片上，于－80℃保存。而固定在多聚甲醛中的其余大腦則脫水包蠟，隨后進(jìn)行連續(xù)石蠟切片，切片厚度為3～4 μm，貼于防脫的玻片上，4℃保存。

1.2.4 鏡下觀察GFP取不同時(shí)間點(diǎn)制成的冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察2組的GFP表達(dá)和腦區(qū)分布。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 取石蠟切片60℃烤片1 h，脫蠟至水，95℃高溫檸檬酸緩沖液中修復(fù)15 min，自然降至室溫后采用3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，加入一抗孵育4℃過夜，其中抗體為兔抗GCDH抗體（1∶50）。PBS沖洗3次后，加入50 μL的ChemMate TM EnVisio+/HRP液體，室溫下孵育30 min。PBS沖洗3次，加入50 μL新鮮配制的DAB溶液，室溫下孵育10 min。顯色完全后，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸酒精分化，1%氨水返藍(lán)，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，隨后光學(xué)顯微鏡下觀察GCDH蛋白的表達(dá)。

1.2.6 Western blot檢測GCDH蛋白表達(dá)注射區(qū)域紋狀體組織提取總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后30 μg蛋白上樣，電泳、經(jīng)SDSPAGE轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃過夜，洗滌加二抗室溫孵育2 h，洗膜，膠片顯影定影。用Image Studio Lite Ver3.1軟件分析光密度，從而得出GCDH蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 HE染色觀察 制備厚度為3～4 μm的連續(xù)石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蘇木素液染色，1%鹽酸-乙醇分化，1%氨水返藍(lán)，0.5%伊紅液染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察組織學(xué)改變。

1.2.8 肝腎功能及血清有機(jī)酸檢測 麻醉大鼠后下腔靜脈取2 mL血，800轉(zhuǎn)離心后提取上層血清，送至我院檢驗(yàn)科生化分析室檢測大鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、尿素（urea，UREA）、肌酐（Creatinine，CR）的水平。下腔靜脈取4～ 8 mL血，離心后提取上層血清，送至武漢康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心檢測戊二酸及3-羥基戊二酸。

1.2.9 Rotarod行為學(xué)檢測 2組大鼠注射慢病毒14 d及1、3月后分別進(jìn)行Rotarod行為學(xué)檢測。在正式測試前連續(xù)訓(xùn)練2 d，每天3次，每次5～10 min，勻速旋轉(zhuǎn)，平均轉(zhuǎn)速20 r/min，剔除不合作及持續(xù)從Rotarod杠桿上落下的大鼠。第3天正式試驗(yàn)，設(shè)置儀器參數(shù)，Rotarod轉(zhuǎn)速在 5 min內(nèi)由4 r/min勻速增加至40 r/min，記錄每只大鼠在Rotarod杠桿上的停留時(shí)間，每只大鼠重復(fù)5次，計(jì)算各組大鼠在注射后不同時(shí)間的平均停留時(shí)間（residence time）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組GFP表達(dá)

2組大鼠注射慢病毒14 d及1、3月后均可在熒光激發(fā)下觀察到GFP在紋狀體神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的明顯表達(dá)，且熒光強(qiáng)度在不同大鼠及不同時(shí)間之內(nèi)趨于穩(wěn)定，見圖1。

2.2 免疫組化檢測不同時(shí)間點(diǎn)紋狀體注射區(qū)域GCDH蛋白表達(dá)

GCDH組在紋狀體慢病毒感染的區(qū)域GCDH蛋白表達(dá)降低，對照組GCDH蛋白表達(dá)無明顯改變，見圖2。

2.3 Western blot檢測不同時(shí)間點(diǎn)紋狀體區(qū)域GCDH蛋白表達(dá)

GCDH組在慢病毒感染區(qū)GCDH蛋白表達(dá)明顯降低，且表達(dá)量隨取材時(shí)間的增加而維持穩(wěn)定，見圖3A。對照組未引起顯著的GCDH表達(dá)改變，GCDH組GCDH蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組（＜0.05），見圖3B。

2.4 HE染色觀察病理改變

各時(shí)間點(diǎn)2組紋狀體HE染色未見明顯的組織病理學(xué)改變，見圖4。

2.5 肝腎功能、血清有機(jī)酸及Rotarod行為學(xué)檢測

2組大鼠慢病毒注射14 d及1、3月后肝腎功能無明顯差異，見表1。2組大鼠血清中難以檢測到戊二酸，3-羥基戊二酸無明顯差異，見圖5。2組大鼠各時(shí)間點(diǎn)平均停留時(shí)間無明顯差異，見圖6。

3 討論

圖1 對照組慢病毒注射14 d后GFP表達(dá)（×100）

圖2 2組大鼠大腦紋狀體免疫組化染色（×400）

圖3 2組大鼠紋狀體GCDH表達(dá)

圖4 2組大鼠大腦紋狀體HE染色（×400）

表1 2組大鼠肝腎功能（±s）

表1 2組大鼠肝腎功能（±s）

組別只數(shù)A S T / ( U / L )A L T / ( U / L )U R E A / ( m m o l / L )C R / ( μ m o l / L )對照組 1 5 1 4 d 1 7 . 0 0 ± 1 . 0 0 1月 1 1 1 . 0 0 ± 1 1 . 1 4 3 8 . 6 7 ± 1 4 . 2 9 5 . 3 3 ± 0 . 6 7 1 7 . 0 0 ± 2 . 0 0 1 2 2 . 0 0 ± 2 2 . 0 7 4 5 . 6 7 ± 3 . 7 9 5 . 4 4 ± 0 . 6 8 2 3 . 3 3 ± 2 . 0 8 G C D H組 1 5 3月7 2 . 6 7 ± 1 1 . 5 0 3 1 . 6 7 ± 6 . 8 1 5 . 4 9 ± 1 . 2 1 1 4 d 1 7 . 0 0 ± 1 . 0 0 1月 1 1 0 . 0 0 ± 1 3 . 2 3 3 7 . 3 3 ± 1 9 . 8 6 5 . 8 7 ± 0 . 4 3 1 5 . 0 0 ± 1 . 0 0 1 2 3 . 3 3 ± 2 8 . 4 5 4 5 . 3 3 ± 4 . 1 6 5 . 7 9 ± 0 . 8 8 3月7 7 . 3 3 ± 1 1 . 5 9 3 2 . 3 3 ± 4 . 9 3 5 . 4 7 ± 0 . 7 0 2 2 . 0 0 ± 2 . 0 0

圖5 對照組（A）、GCDH組（B）大鼠血清有機(jī)酸圖譜

圖6 2組大鼠注射后Rotarod行為學(xué)檢測分析

戊二酸尿癥Ⅰ型是常見的常染色體隱性遺傳病，患兒出生后6～18月因非特異性疾病如感染、常規(guī)免疫接種或手術(shù)等造成的高代謝狀態(tài)誘發(fā)急性腦病危象，導(dǎo)致紋狀體和皮質(zhì)損傷，從而出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙甚至死亡，給家庭和社會(huì)帶來沉重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1,6]。目前已有許多研究者構(gòu)建多種該病模型[2]，比如采用紋狀體內(nèi)直接注射終末代謝產(chǎn)物建立“化學(xué)”大鼠模型；通過在胚胎干細(xì)胞中靶向刪除GCDH基因建立Gcdh基因敲除小鼠模型；對Gcdh基因敲除小鼠給予特殊飲食從而誘發(fā)腦病危象的飲食誘導(dǎo)模型。飲食誘導(dǎo)敲除鼠模型表現(xiàn)類似戊二酸尿癥患者的腦病危象[7]，而賴氨酸飲食誘導(dǎo)敲除小鼠的生存率僅達(dá)到25%，高蛋白飲食誘導(dǎo)的敲除小鼠生存率為0%，并且Gcdh-/-缺陷鼠GCDH完全缺失，而多數(shù)該病患者GCDH活性為0%～15%，盡管這種模型可以模擬腦紋狀體的急性病變，但可能對于這種效應(yīng)有放大的作用。迄今為止，對于GA-1的神經(jīng)病理學(xué)研究中無理想的動(dòng)物模型。

慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)具有產(chǎn)病毒滴度高、低免疫原性、轉(zhuǎn)染效率高和持續(xù)時(shí)間長等特點(diǎn)，可將外源shRNA有效整合到宿主細(xì)胞染色體，能100%感染神經(jīng)元細(xì)胞，是最佳的基因沉默工具[3]。同時(shí)，利用病毒載體作為一種基因?qū)牍ぞ咭殉蔀闃?gòu)建動(dòng)物模型或基因治療的常用工具[8-10]，病毒載體靶向過表達(dá)或沉默某致病基因的方法已成功構(gòu)建如亨廷頓病、帕金森病、Machado-Joseph病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

本研究已成功注射GCDH沉默表達(dá)的慢病毒到大鼠腦紋狀體，結(jié)果顯示GCDH慢病毒注射大鼠腦紋狀體在一定時(shí)間內(nèi)可有效下調(diào)體內(nèi)GCDH基因的蛋白表達(dá)水平，并且這種注射不會(huì)影響腦組織損傷和病理變化，也不會(huì)導(dǎo)致大鼠肝腎功能、有機(jī)酸及行為學(xué)的變化。這些研究均為后續(xù)給予特殊飲食誘導(dǎo)，模擬疾病的發(fā)病情況，探討其發(fā)病機(jī)制和治療提供研究依據(jù)。

[1]Goodman SI,Markey SP,Moe PG,et al.Glutaric aciduria;a"new"disorder of amino acid metabolism [J].Biochem Med,1975,12:12-21.

[2]Jafari P,Braissant O,Bonafé L,et al.The unsolved puzzle of neuropathogenesis in glutaric aciduria typeⅠ [J].Mol Genet Metab,2011,104: 425-437.

[3]Baekelandt V,Claeys A,Eggermont K,et al. Characterization of lentiviral vector-mediated gene transfer in adult mouse brain[J].Hum Gene Ther, 2002,13:841-853.

[4]Gao J,Zhang C,Fu X,et al.Effects of targeted suppression ofGlutaryl-CoA dehydrogenase by lentivirus-mediated shRNA and excessive intake of lysine on apoptosis in rat striatal neurons[J].PLoS One, 2013,8:e63084.

[5]Paxinos G,Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates[M].Sixth edition.Academic Press,New York:2007.

[6]K?lker S,Boy SP,Heringer J,et al.Complementary dietary treatment using lysine-free,arginine-fortified amino acid supplements in glutaric aciduria typeⅠ-A decade of experience[J].Mol Genet Metab, 2012,107:72-80.

[7]Zinnanti WJ,Lazovic J,Wolpert EB,et al.A diet-induced mouse model for glutaric aciduria typeⅠ[J].Brain,2006,129:899-910.

[8]Déglon N,Hantraye P.Viral vectors as tools to model and treat neurodegenerative disorders[J].J Gene Med,2005,7:530-539.

[9]Azzouz M,Kingsman SM,Mazarakis ND. Lentiviral vectors for treating and modeling human CNS disorders[J].J Gene Med,2004,6:951-962.

[10]Alves S,Régulier E,Nascimento-Ferreira I,et al. Striatal and nigral pathology in a lentiviral rat model of Machado-Joseph disease[J].Hum Mol Genet,2008, 17:2071-2083.

Silencing of GCDH expression by Lentivirus-Mediated RNA Interference in Brain Striatal of Rats

Objective:To investigate the silencing effect of injecting the lentivirus-mediated shRNA to GCDH gene on the expression of GCDH in rat striatum.Methods:Three or four weeks old male SD rats were randomly divided into two groups,the GFP gene lentiviral vector injection group (Control group)and the GCDH lentiviral vector injection group(GCDH group).Each group contained 15 rats.Lentiviral vectors expressing GCDH shRNA were administered by striatal injection.The expression of GCDH protein was detected by Western blot and immunohistochemistry day 14,1 and 3 months after the injection.Liver and renal function,serum organic acids and Rotarod Test were also detected.Results:GCDH gene lentiviral vector can down-regulate the expression of GCDH protein in rat striatum.Immunohistochemistry and Western blot detection show that the level of GCDH protein was decreased in the GCDH group compared with that in the controls(<0.05).However,there was no difference in liver and renal functions,serum organic acids and the motor function between the two groups. Conclusion:Injecting lentivirus-mediated shRNA GCDH gene in rat striatum effectively decreases the expression of GCDH.

GCDH;lentiviral vector;gene therapy;striatum

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.01.002

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院a.兒科b.病理科武漢430030

國家自然科學(xué)基金（No.81070699）；科技部國家十二五科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2012BAI09B04）

2013-11-06

羅小平xpluo@tjh.tjmu.edu. cn